缺血后处理对再灌注损伤后炎症因子的调节作用

缺血后处理对再灌注损伤后炎症因子的调节作用

陈艳1高丹姜云鹏张蕾2

(吉林大学基础医学院病理生物学教育部重点实验室,吉林长春130021)

摘要〔〕目的探讨缺血后处理(POC)调节肾缺血再灌注损伤(RIPI)后炎症因子的表达水平及其对大鼠肾脏保护作用的机制。方法成年SD大鼠随机分成：假手术组(Sham组)、缺血再灌注组(I/R组)、POC组。Sham组为对照组。I/R组: 采用无创动脉夹夹闭左肾动脉45 min，切除右肾，然后去除血管夹，恢复血流灌流。POC组:在I/R组的基础上再进行3个循环的30 s缺血/30 s再灌注的手术干预(共计3 min)，最后打开血管夹使血液再灌注。将各组动物于清洁条件下饲养，于第2天及1个月时收集各组动物血清，检测肾脏功能。第2天时，苏木素-伊红(HE)染色观察肾脏组织结构。RT-PCR法检测各组中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6和IL-10的表达水平。结果再灌注第2天，Sham组血清肌酐(Cr)和血尿酸氮(BUN)的浓度维持在正常水平，而I/R组Cr和BUN的浓度明显增高(P<0.01)，POC组Cr和BUN的浓度显著低于I/R组(P<0.05)。再灌注1个月，三组中Cr的浓度无明显差异(P>0.05)。HE染色结果显示，再灌注第2天，Sham组中肾组织形态正常，I/R组肾小管上皮细胞变性，部分脱落，管腔内可见管型，POC组肾组织病变较轻。RT-PCR法检测结果显示，再灌注第2天，Sham组TNF-α、IL-6和IL-10的表达水平很低，I/R组中TNF-α、IL-6的表达水平明显升高，POC组低于I/R组，而IL-10的表达水平明显高于I/R组。结论POC降低了缺血再灌注后的急性炎症反应，从而对大鼠的肾脏起到了保护作用。

关键词〔〕缺血再灌注损伤；缺血后处理；炎症因子

中图分类号〔〕R6〔

通讯作者：张蕾(1974-)，女，博士，副主任医师，主要从事缺血再灌注损伤机制研究。

1吉林大学附属吉林医院 吉林市中心医院病理科

2吉林大学中日联谊医院

第一作者：陈艳(1988-)，女，硕士,主要从事肾缺血再灌注损伤机制研究。

肾脏缺血再灌注损伤(RIPI)广泛发生于肾移植、肾部分切除术、肾动脉血管成形术、肾积水、泌尿外科手术、心肺分流术、主动脉搭桥手术、脓毒症和肝移植等情况下〔1,2〕。肾缺血再灌注后会引发急性炎症反应，包括巨噬细胞和中性粒细胞的浸润和激活，促炎性细胞因子和趋化因子的释放以及黏附分子表达的增强〔3〕。研究表明，急性炎症反应在引起肾脏损害的过程中扮演一个关键性的角色〔4,5〕。缺血后处理(POC)即缺血后持续再灌注前，通过给予多次短暂的再灌注/缺血(I/R)处理可减轻再灌注损伤。但POC的具体保护机制还不明确。本文通过研究POC对大鼠肾脏RIPI后炎症因子的调节作用，从而阐明其对肾脏的保护作用，为其临床应用奠定理论基础。

1材料与方法

1.1材料、试剂及仪器清结级雄性SD大鼠，体重180～220 g，由吉林大学实验动物中心提供。无创动脉夹，手术镊，手术剪，眼科剪，眼科镊，止血钳，持针器，医用纱布，医用手术缝合线，医用棉签，一次性注射器(1 ml,5 ml)，无菌EP管，大鼠饲养笼、垫料及鼠粮等。

戊巴比妥钠(Sigma,USA)，TRIzol®Reagent(Invitrogen,USA)，RNLater(北京泰天和生物技术有限公司)，TaKaRa逆转录试剂盒〔宝生物工程(大连)有限公司〕，无水乙醇(北京化工厂)，0.9%氯化钠注射液(四川科伦药业股份有限公司)，10%中性甲醛缓冲液，伊红染液，苏木精染液等。

半自动轮转式石蜡切片机(Leica RM2245,Germany)，微量台式低温离心机(Thermo Scientific,USA)，PCR仪(Thermo Scientific,USA)，KD-BMⅡ生物组织包埋机(浙江金华科迪仪器设备有限公司)，分析天平(沈阳龙腾电子称量仪器有限公司)，凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)等。

1.2方法

1.2.1动物模型的制备将清洁级雄性成年SD大鼠随机分为，假手术组(Sham组)，缺血再灌注组I/R组及POC组每组8只。应用50 mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉SD大鼠后，将其腹部朝上，四肢固定于手术板上。大鼠腹部皮肤经过75%乙醇消毒后，用手术剪刀剪开腹部，暴露其腹腔脏器，然后用棉签轻轻将其拨开，找到大鼠左侧肾脏，剥离肾蒂被膜，分离出左肾动脉。Sham组大鼠：暴露出左肾但不进行任何处理。I/R组大鼠：用无创动脉夹夹闭左肾动脉45 min，切除右肾，然后去除血管夹，恢复血流灌注。POC组大鼠：用无创动脉夹夹闭左肾动脉45 min，切除右肾，然后去除无创动脉夹，之后进行3个循环的30 s缺血/30 s再灌注的手术干预(共计3 min)，最后打开血管夹恢复血流灌注。各组手术完成后，分别缝合关闭腹腔。将其于清洁级条件下饲养，补充水及饲料。

1.2.2标本的采集将各组动物模型，于清洁级条件下饲养2 d。采用50 mg/kg戊巴比妥钠将大鼠麻醉使其腹部朝上并于手术板上固定，用剪刀沿腹中线打开腹腔，使用一次性注射器抽取其腹静脉血液于已标记好的EP管中，并将其放置冰上暂存。然后找到左肾，用镊子剥离左肾被膜，剪断肾蒂，取出肾脏，立即置于冰上的培养皿中暂存。轻轻挤出肾脏中的血液，应用纱布将其吸干，然后将肾脏纵向切开，取一小块放于10%中性甲醛缓冲液中保存，其余部分组织切碎并分成几份置于已加入RNlater的EP管中，于-20℃冰箱中保存。

1.2.3 肾脏功能学的检测将以上收集的各组动物血液放于4℃离心机中，4 000 r/min，离心10 min。使用加样器分别收集EP管中上层血清成分，注意在吸取的过程中切勿触到下层血细胞。然后分别检测各组动物血清肌酐(Cr)和血尿素氮(BUN)的含量。

1.2.4苏木素-伊红(HE)染色观察肾脏组织结构将10%中性甲醛缓冲液中的组织固定48 h后，对其进行脱水、透明及包埋。使用石蜡切片机对于已包埋好的组织块进行切片，其厚度为5 μm，并于干燥箱中烘干。将各组石蜡切片进行常规的HE染色，并在显微镜下观察各组切片并进行图像的采集。

1.2.5RT-PCR法检测各组中的肿瘤坏死因子(TNF)-α，白细胞介素(IL)-6，IL-10表达水平将保存于RNLater中的肾组织，取出少量，加入一定量的Trizol裂解液，裂解提取总RNA。按照TaKaRa逆转录试剂盒说明书来逆转录合成相应的cDNA，以cDNA 作为模板，分别加入TNF-α、IL-6、IL-10、β-actin引物及其他反应液，然后分别进行反应得到PCR产物。TNF-α引物：正义:5’-GACCCTCACACTCAgATCAT-3′，反义：5′-TTGAAGAGAACCTGGGAGTA-3′；IL-6引物：正义：5′-TCCTACCCCAACTTCCAATGCTC-3′，反义：5′-TTGGATGGTCTTGGTCCTTAGCC-3′；IL-10引物：正义：5′-CACTGCTATGTTGCCTGCTC-3′，反义：5′-TGTCCAGCTGGTCCTTCTTT-3′；β-actin引物：正义：5′- TGTATGCCTCTGGTCGTACC-3′，反义: 5′-CAACGTCACACTTCATGATGG- 3′。采用1.5%琼脂糖凝胶电泳观察PCR产物，应用凝胶图像分析系统进行各电泳带灰度值的测定。

1.6统计学分析应用SPSS17.0软件行t检验。

2结果

2.1血清Cr和血BUN的检测结果在第2天，Sham组Cr〔(0.7±0.08)mg/dl〕和BUN〔(18.7±4.5)mg/dl〕的浓度维持在正常水平，而I/R组Cr〔(5.3±0.75)mg/dl〕和BUN〔(148.1±25.1)mg/dl〕的浓度明显增高(P<0.01)，POC组Cr〔(1.9±0.35)mg/dl〕和BUN〔(49.2±9.1)mg/dl〕的浓度显著低于I/R组(P<0.05)。在再灌注1个月，三组中Cr的浓度无明显差异〔Sham组(0.75±0.04)mg/dl,POC组(1.35±0.08)mg/dl,I/R组(1.75±0.25)mg/dl〕(P>0.05)。I/R组中Cr和BUN的浓度与其他两组差异不明显，但仍有高于Sham组和POC组的趋势〔Sham组BUN(18.7±2.6)mg/dl，POC组(46.1±5.3)mg/dl,I/R组(68.3±13.7)mg/dl〕。

2.2各组动物肾脏组织结构的改变再灌注2 d，Sham组中肾组织形态正常。I/R组中肾组织结构发生显著病变，肾小管上皮细胞肿胀，坏死细胞脱落至管腔造成管腔狭窄，并且出现蛋白管型等。而POC组的肾组织病变较轻，其形态接近于Sham组。见图1。

2.3各组动物TNF-α，IL-6，IL-10的表达水平再灌注2 d，Sham组TNF-α、IL-6、IL-10的表达很低，I/R组中TNF-α、IL-6的表达水平明显升高，POC组TNF-α，IL-6的表达水平低于I/R组，而IL-10的表达水平明显高于I/R组。见图2。

图1　肾脏组织学的检测(×200)

图2　TNF-α、IL-6、IL-10表达水平的检测

3讨论

RIPI是住院患者发病率和死亡率的一个重要原因〔6～9〕。RIPI主要归因于大量的活性氧簇(ROS)的产生以及炎症反应，导致的一系列的细胞凋亡和坏死的发生〔10,11〕。POC是一种有效的保护手段，其最早是由Zhao等〔12〕在犬心肌缺血模型中提出来的，该研究是在再灌注早期通过一系列交替的动脉再灌注和再闭塞的人工操作，其称为后处理。已有报道〔13〕，POC在大脑、心脏、肝脏及肾脏等多种脏器中具有保护作用。

Cr和BUN作为临床上检测肾脏功能的主要指标，其值的升高意味着肾脏的功能受到了损害。本研究结果表明，在缺血再灌注早期，POC可以大幅度降低血清中Cr和BUN的含量，使其恢复正常水平，而且随着时间的延长，I/R大鼠的肾功能逐渐代偿。

TNF-α主要由活化的单核巨噬细胞产生，是炎症反应的一个重要介质。IL-6主要是由淋巴细胞、单核巨噬细胞合成和分泌，也是炎症反应的重要介质，具有多种生物化学活性。本研究说明POC可以有效降低促炎性细胞因子的产生。

IL-10由活化的巨噬细胞产生，作为一种重要的抗炎性细胞因子，能抑制促炎性细胞因子的产生。本研究说明POC可以促进抗炎性细胞因子的产生。

综上所述，POC以降低缺血再灌注后的急性炎症反应，从而对大鼠的肾脏起到了保护作用。

4参考文献

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〔2013-09-12修回〕

(编辑袁左鸣)