糖尿病胃轻瘫大鼠模型制作的实验研究

糖尿病胃轻瘫大鼠模型制作的实验研究

*通信作者 E-mail:1092175568@qq.com

网络出版时间：2015-09-11网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150911.2255.020.html

柏晓辉1， 管志敏1， 潘艳伶2*

(1.贵州医科大学， 贵州 贵阳550001； 2.贵州医科大学 中医科， 贵州 贵阳550001)

[摘要]目的： 探讨小剂量链脲佐菌素注射液(STZ)联合高能量饮食法诱导糖尿病胃轻瘫(DGP)大鼠模型。方法： 将24只大鼠随机均分为正常组和模型组，正常组大鼠予普通饲料喂养，模型组大鼠予高脂高糖喂养，模型组大鼠高脂高糖喂养4周后，予1% STZ溶液腹腔注射3次，剂量分别为20、25、35 mg/kg，第3次注射后4周测大鼠空腹血糖、胃内残留率、血清胃动素(MLT)、胃泌素(GAS)，同时取大鼠胃组织，观察胃窦平滑肌细胞。结果： 模型组大鼠空腹血糖、胃内残留率、MLT、GAS明显高于正常组，差异具有统计学意义(P<0.01)；模型组大鼠胃窦平滑肌细胞形态学改变较正常组大鼠有明显差异。结论： 小剂量STZ联合高能量饮食法可成功复制DGP大鼠模型。

[关键词]糖尿病； 胃轻瘫； 动物，模型； 大鼠； 链脲佐菌素，小剂量； 高脂高糖食物

[中图分类号]R573.9； R587.1

Experimental Study on the Model of Diabetic Gastroparesis Rat

BAI Xiaohui1, GUAN Zhimin1, PAN Yanling2

(1.GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.DepartmentofTraditionalChineseMedicine,

theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550001,Guizhou,China)

Abstract[] Objective: To investigate the establishment of rat model of diabetic gastroparesis (DGP) by low dose of STZ combined with high energy diet. Methods: Twenty-four rats were randomly divided into normal group and model group, 12 rats in each group. Rats in normal group were fed with common diet while rats in model group were fed with high energy diet. After four weeks of high energy diet feeding, rats in model group received intraperitoneal injection of low dose of STZ solution three times, 20, 25, 35 mg/kg respectively. Four weeks after the third injection, FBG level, the gastric emptying rate, serum MLT, GAS content of rats were detected. And the gastric tissue of rats was taken out to observe morphological changes of gastric smooth muscle cell. Results: The FBG level, gastric emptying rate, serum MLT and GAS content of rats in model group were significantly higher than their counterparts in normal group (P<0.01). The morphological changes of gastric smooth muscle cell in model group were different from those in normal group. Conclusion: Low dose of STZ combined with high energy diet can successfully establish the rat model of DGP.

[Key words] diabetes mellitus; diabetic gastroparesis; animals model; rat; streptozotocin,small dose; high energy diet

随着糖尿病发病率的持续上升[1]，糖尿病胃轻瘫(DGP)发生率也呈现迅猛增长的势头。据国内外相关资料统计，50%～76%糖尿病患者并发胃轻瘫，特别在晚期糖尿病患者中高达75%[2-3]。为深入研究本病的防治，建立一种理想的动物模型十分必要。本文对小剂量链脲佐菌素注射液(STZ)联合高能量饮食法建立大鼠DGP模型进行了研究，报告如下。

1材料与方法

1.1动物与材料

SPF级SD大鼠,健康雄性24只，体重(200±20)g，由贵州医科大学实验动物中心提供,实验动物许可证号SCXK(黔)2002-0001。本实验所用STZ由美国Sigma公司生产，大鼠胃动素(motilin，MLT)酶联免疫分析试剂盒、大鼠胃泌素(gastrin，GAS)酶联免疫分析试剂盒，均购于昆明腾昆科技有限公司。普通饲料配方：碳水化合物50%，脂肪10%，蛋白质20%。高能量饲料配方：碳水化合物61%，脂肪14%，蛋白质14%，蔗糖10%，胆固醇1%。

1.2方法

将24只大鼠适应性喂养1周后，随机分为正常组(12只)、模型组(12只)，正常组予普通饲料喂养，模型组大鼠予高能量饲料喂养，连续4周；4周后模型组大鼠经腹腔注射0.1 mol/L枸橼酸缓冲液配制STZ溶液，剂量为20 mg/kg，72 h后尾静脉取血测空腹血糖>16.7 mmol/L为模型组[4]。首次造模后12只大鼠空腹血糖均未达糖尿病标准，未有死亡；第二次予25 mg/kg剂量腹腔注射STZ溶液，72 h后测空腹血糖仍未达标(较首次空腹血糖明显升高)，未有死亡；第3次予35 mg/kg剂量腹腔注射STZ溶液，72 h后测空腹血糖有11只大鼠血糖达标，1只死亡。正常组经腹腔注射等量枸橼酸钠缓冲液。实验期间所有大鼠随意饮水。

1.3检测指标

在实验结束处死大鼠前禁食不禁水24 h，处死大鼠30 min前予半固体糊状物(羟甲基纤维素5 g、奶粉8 g，糖4 g，淀粉4 g，加水125 mL配成约150 g糊状物)2 mL/只进行灌胃；30 min后股动脉采血处死大鼠，每只大鼠取血5 mL，标本静置30 min后，以3 000 r/min离心10 min，分离出血清，用酶联免疫法检测MLT、GAS含量，标本处理及操作均严格按照试剂盒说明书进行。处死大鼠后随即剖腹取胃(将喷门和幽门结扎后剪断)，拭净，称胃全重，沿胃大弯将其剖开，除去胃内容物、清洗胃后拭干再称其重量，测胃内残留率[5]，胃内残留率=(胃全重-胃净重)/糊重×100%。取胃窦组织约10 mm×2 mm，放入10%福尔马林液固定病理切片，观察胃窦平滑肌细胞形态。

1.4统计学方法

2结果

2.1造模后空腹血糖、胃内残留率

模型组大鼠造模后空腹血糖及胃内残留率较正常组明显升高(P<0.01)，证明本实验复制DGP大鼠成功。见表1。

表1　两组大鼠造模后空腹血糖及

(1)与正常组比较，P<0.01

2.2血清MLT、GAS含量

由表2可见，模型组大鼠血清MLT、GAS含量较正常组显著升高(P<0.01)，通过胃肠激素水平进一步证明本实验大鼠DGP模型复制成功。

表2　两组大鼠血清MLT及GAS含量比较

(1)与正常组比较，P<0.01

2.3胃窦平滑肌细胞形态

正常组大鼠胃窦平滑肌细胞多呈梭形，细胞核规则，呈长椭圆形，核膜相对平滑，褶皱少而浅，异染色质分布均匀，胞质内密斑、密体明显，肌丝清晰可见。模型组大鼠胃窦平滑肌细胞变小，细胞核不规则、核膜皱缩明显，染色质呈致密块状，深染、边聚，密体、肌丝减少。见图1。

3讨论

2011年全世界糖尿病患者约3.66亿人，比2010年增加了0.8亿多，提升近30%，统计当年每1 min约有10人死于糖尿病并发症[6]。作为糖尿病常见慢性并发症之一，DGP不仅能引起病人血糖控制不佳，还可诱发机体营养不良及内环境紊乱，导致全身衰竭，加剧病情恶化[7]。 DGP的发展将严重影响糖尿病其他并发症的发生与进展，DGP不仅是患者关注的焦点，也是医学工作者研究的热点，复制DGP大鼠模型对研究糖尿病引起的DGP的发生机制及有效治疗十分重要。

正常组　　　　　　　　　　　　　　　　　模型组 图1　正常组和模型组大鼠胃窦平滑肌细胞(HE, ×100) Fig.1　Comparison of morphological changes of smooth muscle cell of sinuses ventriculi

目前，DGP大鼠造模主要有实验诱导法和自发性糖尿病模型，因自发性动物模型价格昂贵，且造模过程时间长，所需饲养条件及饲料要求严格而难以得到进一步推广，故在实验研究中，主要常用实验诱导法。实验诱导法又包含特殊膳食诱导和化学药物诱导两种，特殊膳食主要以高能量饲料为主。Chalkley等[8]发现，用高能量膳食诱导健康动物一定时间后可出现胰岛素抵抗，但不能达到高血糖，即便能诱导出高血糖模型也需要比较长的时间，大概半年到两年不等。Maria等[9]用高脂肪食料饲养小鼠，1年后观察到小鼠葡萄糖耐受试验明显异常，且发现胰岛素量代偿性增加，可但空腹血糖变化不大。化学药物诱导DGP模型的应用较多的试剂有STZ和四氧嘧啶(ALX)，STZ、ALX均能有目的性的破坏哺乳动物胰岛β细胞。ALX价廉，造模过程中动物的死亡率较高，注射后动物对其有依懒性；而STZ虽价格比ALX稍高，但其诱导的模型较稳定，死亡率低，故实验研究中用STZ较广泛。目前动物实验使用STZ造模的主要有两种方式，一种是单次大剂量注射STZ[10-12]，可使动物血糖迅速升高，适合短时间内需求高血糖动物模型的实验所用，此种造模方式复制的动物模型更类似1型糖尿病，但单次大剂量注射STZ后会使动物血糖过高，极易发生酮症死亡，故此种方法造模的死亡率亦偏高，且动物模型不稳定；另一种方法是多次小剂量腹腔注射STZ溶液，可使血糖水平逐步上升，但此种方法是通过直接破坏胰岛β细胞实现的，而与人类DGP发生过程差距较大。在复制糖尿病胃轻瘫模型的研究中较多使用的有ALX联合熟地灌胃以及小剂量STZ联合高能量饮食喂养两种。

本实验采用特殊膳食和化学药物联合诱导的造模方式，共分为两期，第一期即特殊膳食诱导期，予大鼠高能量饲料喂养，4周后高能量喂养的模型组大鼠体重明显增加，这一期大鼠的状况接近人类糖尿病前期的脂代谢紊乱期；第二期为化学药物诱导期，特殊膳食4周后，给大鼠小剂量链脲佐菌素溶液腹腔注射3次，逐渐破坏大鼠胰岛β细胞。运用化学药物加速胰岛β细胞的破坏，使其在病理机制上更接近于人类DGP发生发展过程。本实验以空腹血糖和胃内残留率作为检测造模成功的指标，模型组大鼠空腹血糖明显升高、胃内残留率升高，组织细胞图片显示胃窦平滑肌细胞的轻微改变，血清MLT、GAS水平升高，证实复制DGP模型成功，且造模过程中大鼠存活率达91.67%，表明本实验造模方法可获得研究糖尿病DGP动物模型。

4参考文献

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(2015-06-01收稿，2015-08-11修回)

中文编辑： 文箐颍； 英文编辑： 刘华