表面增强拉曼光谱法快速鉴别非法染色的关黄柏药材

通信作者：陆峰，男，博士研究生，教授，研究方向：药物、生物光谱信息学，拉曼光谱的基础和应用研究，Tel：021-81871268,E-mail：fenglufeng@hotmail.com

表面增强拉曼光谱法快速鉴别非法染色的关黄柏药材

李丹1,汪冰2,李晓1,张中湖2，巩丽萍2，陆峰1,褚克丹1

(1.福建中医药大学,福建 福州 350122;2.山东省食品药品检验研究院,山东 济南 250101)

摘要：目的采用表面增强拉曼光谱法(SERS)对非法染色的关黄柏进行快速检测。方法采用原位还原法制备的银胶纸作为SERS基底，擦拭经乙醇溶液润湿的关黄柏，银胶纸的擦拭区立即进行SERS检测。本文先后对硝酸银的浓度、银胶纸的增强效果及稳定性等因素进行考察和优化。结果成功鉴别经0.01 mg·mL-1金胺O染料染色的关黄柏。结论表面增强拉曼光谱法可实现对染色黄药材的快速、简单、灵敏和无损的鉴别。

关键词：表面增强拉曼光谱；银胶纸;关黄柏；非法染色；金胺O

作者简介：李丹，女，研究方向：纸基-SERS法及其在复杂样品检测中的研究，E-mail:cicilee08@163.com

中图分类号：R286.0文献标识码：A

Identification of dyeing adulteration in Amur Cork-tree Bark by

surface-enhanced Raman spectroscopy

LIDan1,WANGBing2,LIXiao1,ZHANGZhong-hu2,GONGLi-ping2,LUFeng1,CHUKe-dan1

(1.FujianUniversityofTraditionalChineseMedicine，Fuzhou350122，China；2.ShandongInstitute

forFoodandDrugControl，Jinan250101，China)

Abstract：ObjectiveTo establish a surface-enhanced Raman scattering (SERS) method for the detection of dyed Amur Cork-tree Bark.MethodsSupported silver nanoparticles on filter paper were synthesized by the method of in situ reduction.Experimental designs were performed to obtain the best detection results by studying the parameters：the concentration of silver nitrate solution,the enhancement effect and stability of the Ag NPs-paper.ResultsThe dyed Amur Cork-tree Bark,stained by Auramine O at the concentration of 0.01 mg·mL-1,had been successfully detected.ConclusionCompared with the Ag NPs-paper and SERS technology,the scheme provided a simple and rapid detection method of dyed Amur Cork-tree Bark.

Key words:SERS;Ag NPs-paper;Amur Cork-tree Bark;Dyeing adulteration;Auramine O

1前言

近些年来，随着药材市场的不断发展，掺伪造假的现象也层出不穷[1]，常见造假现象包括增加饮片重量、掺伪、染色等，其中非法染色尤为突出。非法染色的药材多为冒充贵细药材，经染色后外观酷似正品， 大多数消费者难以识别。金胺O，又称碱性嫩黄O、盐基淡黄、盐基槐黄、碱性槐黄等，工业上用于蚕丝、腈纶、皮革及纸张等物品的染色；另外，金胺O用于黄色中药材的非法染色的现象也屡见不鲜[2~4]。关黄柏为芸香科植物黄檗PhellodendronamurenseRupr.的树皮，性寒，味苦，常用于湿热泻痢、黄疸、带下、热淋、脚气、骨蒸劳热、盗汗、遗精、疮疡肿毒等病症[4]，然而，接触或食用金胺O染色的黄柏药材，会引起癌肿[5]。因此，建立关于非法染色关黄柏的快速、简单和准确的鉴别方法十分必要。

目前，国内外对染色中药材、中药饮片和常见色素的检测方法包括：理化和经验鉴别、色谱、质谱及其连用技术、光谱法等[2~14]。例如：饶伟文等[9]人采用薄层色谱法和HPLC-DAD鉴定相关药材，并在掺假蒲黄和黄芩中检测出金胺O，在红花中检测出金橙Ⅱ；莫连峰等[10]用HPLC法测定染色黄芩中金胺O的含量，检测的14批市售蒲黄，其中有7批检测出金胺O；Di Anibala等[13]利用表面增强拉曼光谱(SERS)法和算法分析技术成功鉴别了辣椒粉中的苏丹红染料。从研究者之前的工作中不难发现，薄层色谱法操作简单，成本较低，但影响因素较多，一般用于定性初筛；色谱、质谱及其联用技术具有样品用量少、灵敏度高等特点，但检测时间长，且需对样品进行一定的前处理；而光谱技术，特别是近些年来兴起的SERS技术可以实现色素快速、无损的鉴别，且具有制样简单、检测时间短等优点，因此，SERS具备成为快速、准确检测非法染色的中药材方法的潜质。

本文以非法染色的关黄柏为研究对象，选用还原法制备的银胶纸作为SERS基质，成功鉴别了低浓度金胺O染色的关黄柏。先后对硝酸银的浓度、银胶纸的增强效果和稳定性等因素进行考察和优化，以期建立非法染色关黄柏的快速、准确的鉴别方法，此法的建立有利于进一步加大对中药材、中药饮片市场的监管，保障消费者的用药安全。

2仪器与试剂

2.1仪器蔡氏扫描电镜(EVO MA-10 Germany)；i-Raman(BWS415,B&W Tek,U.S.A)，激发波长为785 nm，分辨率为5 cm-1；KQ-250DB型数控超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

2.2试剂和样品硝酸银、硼氢化钠和无水乙醇均为分析纯(上海国药集团化学试剂有限公司)；定量滤纸(杭州特种纸业有限公司)；纯净水；金胺O和结晶紫(CV)(阿拉丁试剂公司)；关黄柏购于药店。

3实验部分

3.1染色关黄柏的制备精密称取CV和金胺O粉末0.003 g，分别溶解于纯净水和乙醇3 mL，振荡溶解，即制得浓度为1 mg·mL-1的染料标准溶液，其余浓度的染料溶液通过逐级稀释获得。取适量关黄柏进行染色，染色后的药材烘干待用。

3.2原位还原法制备银胶纸

3.2.1精密称取17、51、85、136和170 mg硝酸银，分别溶解于10 mL纯净水，制备0.01、0.03、0.05、0.08 和0.10 mol·L-1的硝酸银溶液，避光保存待用；精密称取46.8 mg 硼氢化钠，溶解于60 mL的纯净水，制备0.2 mol·L-1的硼氢化钠溶液，待用。

3.2.2原位还原法[15，16]制备银胶纸将定量滤纸浸泡在上述硝酸银溶液中，待6 min后取出；分别取0.2 mol·L-1的硼氢化钠溶液10 mL进行原位还原，反应片刻后用纯净水淋洗数次后干燥待用。

3.3金胺O的标准图谱的获得采用移液枪移取1 mg·mL-1的金胺O标准溶液1 μL，滴加于优化过的银胶纸上，滴加区立即进行SERS检测，即获得染料的标准SERS图谱。

3.4染色关黄柏的检测与优化采用移液枪移取25 μL的乙醇-水混合溶液润湿染色后的关黄柏数秒，用干燥的银胶纸擦拭药材的润湿区域数秒，擦拭后的银胶纸立即进行SERS检测。

4结果与讨论

4.1硝酸银溶液浓度的考察和优化

4.1.1硝酸银浓度对增强效果的影响选取0.1 mg·mL-1的CV作探针对不同浸泡时间所制得银胶纸的增强效果进行考察，取1 μL该溶液点于浸泡0.01、0.03、0.05、0.08和0.10 mol·L-1的硝酸银溶液后制得的银胶纸上，点样区立即进行SERS检测，结果见图1(A)。选用1 170 cm-1处的特征峰强度[17]作为标准比较增强效果，将3次检测的平均强度做柱状图，如图1(B)所示，采用0.05 mol·L-1的硝酸银制备的银胶纸增强效果最好；且当浓度超过0.05 mol·L-1时，增强效果有所减弱，这可能是由于高浓度的硝酸银在空气中发生了氧化反应。因此，选择0.05 mol·L-1硝酸银溶液制备的银胶纸进行下述实验。

图1　(A)1 μL 0.1 mg·mL -1的CV滴于各银胶纸上所得SERS检测图谱；(B)银胶纸增强效果柱状图， 从左至右依次为：0.01、0.03、0.05、0.08和0.10 mol·L -1

4.1.2银胶纸增强因子的计算采用下述公式计算新制备银胶纸的增强因子(EF)[18]：

EF=Is×NR/(IR×Rs)

其中，I表示1 170 cm-1处的拉曼峰强度，N表示沉积于SERS基底上的CV的分子数。使用图1A的数据进行计算，银胶纸的增强因子为4.6×103。

4.2银胶纸的表征采用扫描电镜对银胶纸进行表征，结果见图2。如图所示，定量滤纸(A)表面仅能观察到纸纤维；而采用原位还原法制备的滤纸(B)表面大量的银纳米粒子清晰可见且颗粒尺寸在 50～100 nm 左右，这为“SERS热点”的获得提供了保证。

图2　滤纸(A)和银胶纸(B)的扫描电镜图 (放大倍数分别是2 000倍和50 000倍)

4.3银胶纸稳定性的考察同样选取0.1 mg·mL-1的CV作探针对储存10 d内银胶纸的增强效果进行考察，取1 μL该溶液点于银胶纸上，点样区立即进行SERS检测。选用1 170 cm-1处的特征峰强度作为标准比较增强效果，3次检测的平均强度与存放时间(d)的关系如图3所示：随着储存时间的延长，银胶纸的增强效果有所降低，但一周内基本保持稳定。

4.4染色关黄柏的鉴别首先，采用表面增强拉曼

图3　经不同储存时间后银胶纸的增强效果变化 (从左至右依次为：1、3、5、7和10 d)

光谱法鉴别市售关黄柏药材，滴加乙醇-水的混合溶液25 μL润湿药材表面数秒，取银胶纸擦拭后进行SERS检测。0.1 mg·mL-1的金胺O的标准SERS图及市售关黄柏的擦拭检测结果见图4(A)，用OPUS软件进行特征峰的标示后发现金胺O在415、456、505、562、734、776、1 160、1 480、1 548及1 594 cm-1等多处存在特征峰；市售关黄柏药材的擦拭检测光谱(红)与空白银胶纸的光谱(蓝)相比，在729 cm-1处存在特征峰，初步判定为关黄柏药材浸出物的特征峰。

随后，检测1、0.1和0.01 mg·mL-1的金胺O染料染色的关黄柏药材。操作步骤同上所述，检测图谱见图4(B)。如图所示：染色样品的检测图谱除729 cm-1处出现关黄柏基质峰外，在415、505、562、734、776、1 160 cm-1等处还存在金胺O的特征峰。因此，采用此法可快速判别关黄柏药材是否被金胺O非法染色。另外，经0.01 mg·mL-1染料溶液染色前后关黄柏无明显颜色变化，但仍可检测出金胺O，因此此法可满足真实鉴别的需求。

图4　 (A)0.1 mg·mL -1金胺O的标准图、市售关黄柏药材的擦拭检测结果以及银胶纸的空白光谱; (B)经不同浓度的金胺O(1、0.1、0.01 mg·mL -1)染色关黄柏的鉴别结果

5结论

采用表面增强拉曼光谱法成功鉴别了金胺O非法染色的关黄柏药材；本文先后对硝酸银的浓度、银胶纸的增强效果以及稳定性等因素进行考察和优化，成功检测经0.01 mg·mL-1金胺O染料染色的关黄柏，已可以满足真实鉴别的需求。随着研究的不断深入，表明增强拉曼光谱法的应用将有利于进一步加大对中药材、中药饮片市场的监管，保障消费者的用药安全。

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