HPLC法同时测定华山参中山莨菪碱、东莨菪碱、阿托品的含量

HPLC法同时测定华山参中山莨菪碱、东莨菪碱、阿托品的含量

陈妤1,2，闫晓楠1,2，杨晓宏3

(1.天津中新药业研究中心，天津 300457；2.天津市中药质量控制重点实验室，天津 300457；

3.天津中新药业集团股份有限公司，天津 300193)

摘要：目的建立高效液相色谱法同时测定华山参中山莨菪碱、东莨菪碱、阿托品的含量。方法色谱柱：Agilent Zorbax SB-Aq C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈-50 mmol·L-1磷酸二氢钾(含0.08%三乙胺，用磷酸调pH至6.0)(15∶85)；检测波长：210 nm；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1。结果山莨菪碱在0.058 8～2.949 1 μg线性范围内呈良好的线性关系(r=0.999 9)，平均回收率为100.03%(n=6)，RSD为0.13%；东莨菪碱在0.145 7～7.284 1 μg线性范围内呈良好的线性关系(r=0.999 9)，平均回收率为100.77%(n=6)，RSD为0.97%；阿托品在0.161 7～8.084 4 μg线性范围内呈良好的线性关系(r=0.999 9)，平均回收率为99.20%(n=6)，RSD为0.80%。结论方法稳定、可靠，可作为华山参的质量控制方法。

关键词：华山参；山莨菪碱；东莨菪碱；阿托品；高效液相色谱法

作者简介：陈妤,女，研究方向：药物分析，E-mail:chen2351@126.com

中图分类号：R927.2文献标识码：A

Determination of anisodamine,scopolamine and atropine in Huashanshen by HPLC

CHENYu1,2，YANXiao-nan1,2，YANGXiao-hong3

(1.TianjinZhongxinPharmaceuticalR&DCenter，Tianjin300457，China;2.TianjinTraditional

ChineseMedicineQualityControlKeyLaboratory，Tianjin300457，China;3.Tianjin

ZhongxinPharmaceuticalGroupCo.,Ltd.，Tianjin300193，China)

Abstract：ObjectiveTo establish an HPLC method to determine anisodamine,scopolamine and atropine in Huashanshen.Methods Anisodamine,scopolamine and atropine were assayed on an Agilent Zorbax SB-Aq C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)column;The mobile phase composed of acetonitrile-50 mmol·L-1 potassium dihydrogen phosphate (containing 0.08% triethylamine,adjust pH to 6.0 with phosphatic acid)(15∶85) at a flow rate of 1.0 mL·min-1;The determination wavelength was 210 nm.ResultsThe calibration curves were linear in the range of 0.058 8～2.949 1 μg(r=0.999 9)for anisodamine,0.145 7～7.284 1 μg(r=0.999 9)for scopolamine and 0.161 7～8.084 4 μg(r=0.999 9)for atropine,respectively.The average recoveries (n=6) of anisodamine,scopolamine and atropine were 100.03%(RSD=0.13%),100.77%(RSD=0.97%) and 99.20%(RSD=0.80%),respectively.ConclusionThe method was simple and reliable,accurate,repeatable and can be used for the quality control of Huashanshen．

Key words:Huashanshen;Anisodamine;Scopolamine;Atropine;HPLC

华山参为茄科泡囊草属植物漏斗泡囊草(PhysochlainainfundibularisKuang)的干燥根，具温肺祛痰，平喘止咳的功效，用于寒痰喘咳，惊悸失眠，为《中国药典》2010年版所收载。华山参的主要成分有阿托品、东莨菪碱、山莨菪碱等托烷生物碱，东莨菪内酯、华山参苷和东莨菪苷等香豆素类化合物，以及氨基酸、多糖等多种成分[1,2]。《中国药典》2010年版采用紫外-可见分光光度法测定华山参中总生物碱的含量，规定华山参药材中含总生物碱以莨菪碱计算，不得少于0.2%，该方法操作复杂，准确性和重现性差[3]。同时，《中国药典》2010年版采用HPLC法测定其中东莨菪内酯含量，但该成分在很多植物中均含有，专属性不足。本研究建立了同时测定华山参中山莨菪碱、东莨菪碱和阿托品含量的HPLC法，结果准确，重复性好，快速简便，可作为华山参药材更加有效的质量控制方法。

1仪器与试药

Agilent 1200高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；Waters 2695高效液相色谱仪(美国沃特世公司)。氢溴酸山莨菪碱对照品(批号：100051-201105)，氢溴酸东莨菪碱对照品(批号：100049-201009)和硫酸阿托品对照品(批号：100040-200510)均购自中国药品生物制品检定所；华山参由天津中新药业集团有限公司第六中药厂提供，经检验符合《中国药典》2010年版(一部)“华山参”项下的相关规定；乙腈、甲醇为色谱纯，水为纯化水，其他试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1色谱条件色谱柱：Agilent Zorbax SB-Aq C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈-50 mmol·L-1磷酸二氢钾(含0.08%三乙胺，磷酸调pH至6.0)(15∶85)；检测波长：210 nm；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1，理论塔板数按东莨菪碱峰计算应不低于10 000。

2.2对照品和供试品的配制

2.2.1对照品溶液的制备分别取氢溴酸山莨菪碱、氢溴酸东莨菪碱和硫酸阿托品对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含氢溴酸山莨菪碱30 μg、氢溴酸东莨菪碱30 μg、硫酸阿托品60 μg的混合溶液，即得。

2.2.2供试品溶液的制备取华山参药材细粉1 g，精密称定，置具塞瓶中，精密加入60%甲醇25 mL；密塞；超声处理30 min，放冷，微孔滤膜(0.45 μm)滤过，即得。

2.3测定方法精密吸取上述供试品溶液与对照品溶液10 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算样品的含量。根据分子式计算，氢溴酸山莨菪碱折算成山莨菪碱系数为0.790 6，氢溴酸东莨菪碱折算成东莨菪碱系数为0.789 4，硫酸阿托品折算成阿托品系数为0.855 1(见图1、2)。

2.4方法学考察

2.4.1标准曲线的制备精密称取氢溴酸山莨菪碱对照品适量，精密称定，配制成5.88、11.82、23.63、59.10、88.49、294.91 μg·mL-1的对照品溶液。精密称取氢溴酸东莨菪碱对照品适量，精密称定，配制成14.57、29.14、58.27、145.73、218.54、728.41 μg·mL-1的对照品溶液。精密称取硫酸阿托品碱对照品适量，精密称定，配制成16.17、32.34、64.67、161.71、242.53、808.44 μg·mL-1的对照品溶液。分别取上述对照品10 μL注入高效液相色谱仪，以进样量为横坐标,相应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并以最小二乘法计算得氢溴酸山莨菪碱、氢溴酸东莨菪碱、硫酸阿托品的标准曲线分别为：

Y=1 350.015 4X+1.768 9(r=0.999 9)；

Y=992.680 4X+11.288 3(r=0.999 9)；

Y=1 212.888 3X+16.145 1(r=0.999 9)。

结果显示，氢溴酸山莨菪碱对照品在0.058 8～2.949 1 μg、氢溴酸东莨菪碱对照品在0.145 7～7.284 1 μg、硫酸阿托品对照品在0.161 7～8.084 4 μg的范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.4.2仪器精密度试验取供试品溶液，按以上色谱条件于同一日内重复进样6次，测定峰面积，结果氢溴酸山莨菪碱、氢溴酸东莨菪碱、硫酸阿托品的RSD(n=6)分别为0.56%、0.48%、0.41%。

2.4.3样品溶液的稳定性试验取供试品溶液，按以上色谱条件每隔1 h进样1针，测定峰面积，结果在12 h内测定，供试品溶液氢溴酸山莨菪碱峰面积RSD为0.64%，氢溴酸东莨菪碱峰面积RSD为0.38%，硫酸阿托品峰面积RSD为0.57%。结果表明，供试品溶液在12 h内基本无变化，稳定性良好。

图1　混合对照品色谱图 1.氢溴酸山莨菪碱；2.氢溴酸东莨菪碱;3.硫酸阿托品

图2　华山参样品色谱图

2.4.4重复性试验精密称取同一批号样品6份，制备供试品溶液，测定峰面积并计算山莨菪碱、东莨菪碱、阿托品含量，结果山莨菪碱平均含量为2.81 mg·g-1，RSD为0.49%(n=6)。东莨菪碱平均含量为1.20 mg·g-1，RSD为0.32%(n=6)。阿托品平均含量为4.43 mg·g-1，RSD为0.63%(n=6)。

2.4.5加样回收率试验精密称取已知含量样品6份，每份0.5 g，精密加入氢溴酸山莨菪碱、氢溴酸东莨菪碱、硫酸阿托品对照品适量，制备供试品溶液，测定峰面积并计算含量，结果表明山莨菪碱回收率的平均值为100.03%，RSD为0.13%。东莨菪碱回收率的平均值为100.77%，RSD为0.97%。阿托品回收率的平均值为99.20%，RSD为0.80%。表明本方法回收率较好，方法可行，结果见表1~3。

表1　山莨菪碱加样回收试验测定结果

表2　东莨菪碱加样回收试验测定结果

表3　阿托品加样回收试验测定结果

2.4.6样品含量测定取华山参药材，按“2.2.2”项下操作，测定山莨菪碱、东莨菪碱和阿托品的含量，并计算分离度和理论塔板数，结果见表4。

表4　华山参样品含量测定结果

3讨论

3.1分别选择色谱柱Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Hypersil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Agilent Zorbax SB-Aq C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，根据样品分离效果、理论塔板数等柱效参数，综合考虑山莨菪碱、东莨菪碱和阿托品的测定要求及分离效果，选择Agilent Zorbax SB-Aq C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)作为色谱柱。

3.2试验中参考比较了3种流动相体系：①周军等[4]对华山参滴丸中3种生物碱的测定方法，采用乙腈-醋酸盐体系，结果样品中3种生物碱的分离较好，但此流动相体系存在基线漂移的问题，而且梯度洗脱过于复杂；②康辉等[5]的研究中，采用甲醇-磷酸水体系，虽然山莨菪碱的分离较好，但对于东莨菪碱的分离较差，而且阿托品峰严重拖尾；③本文参考《中国药典》[6]中硫酸阿托品的含量测定方法，选择乙腈-磷酸二氢钾体系，在此体系中不加入离子对试剂，减少对色谱柱的损害，加入适量三乙胺，调整峰形，并用磷酸调至pH为6.0，结果表明色谱图中山莨菪碱、东莨菪碱、阿托品与杂质峰分离效果最佳，峰型最好。

参考文献3.3[4~7]报道中，山莨菪碱、东莨菪碱和阿托品的检测波长为210 nm；采用二极管阵列检测器对山莨菪碱、东莨菪碱和阿托品进行光谱扫描，结果表明3种生物碱的最大吸收也均在196 nm。考虑到末端吸收的干扰，本文借鉴参考文献选取210 nm作为检测波长，该波长下各色谱峰响应良好，而且没有杂峰干扰。

参考文献3.4根据[7]考察了前处理中提取方法(超声、回流)、提取溶剂(甲醇、30%甲醇、60%甲醇、水)、提取体积(10、25、50 mL)、提取时间(20、30、40 min),对华山参中山莨菪碱、东莨菪碱、阿托品提取情况的影响，结果显示使用超声提取的方法，精密加入60%甲醇25 mL，超声处理30 min，可以将华山参中山莨菪碱、东莨菪碱和阿托品提取完全。

通过方法学考察建立了高效液相色谱法测定华山参中山莨菪碱、东莨菪碱、阿托品含量的方法。本方法简便易行，结果准确，重复性好，可作为华山参药材质量控制的方法。

参考文献：

[1]李松武,赵云荣,庆伟霞,等.华山参的研究进展[J].济源职业技术学院学报,2005,4(2)：8-10.

[2]赵森淼,侴桂新,王峥涛.华山参化学成分研究[J].中草药,2013,44(8)：938-941.

[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版(一部)[S].北京：中国医药科技出版社，2010：692.

[4]周军,苗淑森,胡永峰,等.HPLC法测定华山参滴丸中消旋山莨菪碱、东莨菪碱及阿托品的含量[J].药物分析杂志,2010,30(5)：838-841.

[5]康辉,聂桂华,代雪平.HPLC法测定华山参中山莨菪碱的含量[J].中医研究,2010,23(10):33-35.

[6]国家药典委员会．中华人民共和国药典2010年版(二部)[S].北京：中国医药科技出版社，2010：981.

[7]代雪平,宋汉敏.华山参中东莨菪苷的含量测定研究[J].现代中药研究与实践,2012,26(5)：66-68.