122份小麦品种（系）抗叶锈病基因Lr 26、Lr 34、Lr 38分子标记检测

隋建枢， 王化陆， 辛智海， 王 伟， 陈天青， 何庆才

（1.贵州省旱粮研究所， 贵阳550006； 2.贵州大学生命科学院， 贵阳550025；3.贵州省植保研究所， 贵阳550006）

小麦叶锈病（Leaf rust）是由小麦叶锈菌（Puccinia tirticina）引起的真菌病害，在我国各地均有发生，以西南及长江流域的部分地区如贵州、江西等地发生较重，严重时可造成5%～15%甚至更大的产量损失［1］。近年来，华北、西北及东北各地小麦叶锈病也日趋严重。由于育种家的忽视，使得小麦抗叶锈病品种很少，因此部分地区的叶锈病有加重趋势［2］。贵州气候温暖湿润，常年相对湿度在70%以上，并且随着田间栽培环境的改变、全球性气候变暖，使得小麦叶锈病呈逐年增加的趋势，成为影响小麦稳产、高产的主要病害之一。选育和利用抗病品种是控制小麦叶锈病最经济、有效、且对环境安全的重要措施。

截止2010年，已经发现近100个抗叶锈病基因，其中72个被正式命名，67个被定位，39个抗病基因被标记［3］。而我国小麦主要抗叶锈病基因有：Lr 1、Lr 3、Lr 3 bg、Lr 10、Lr 13、Lr 14 a、Lr 16、Lr 23、Lr 26、Lr 34和Lr 35，其次还有Lr 9、Lr 11、Lr 12、Lr1 9、Lr2 4和Lr3 8等［4］。通过抗叶 锈 性 表 现 与 分子标记型的比较发现，用分子标记对小麦基因组DNA所含抗叶锈基因的鉴定准确率很高，准确快速，是辅助选择与准确鉴定抗病基因的有效方法。魏新燕等［5］用与抗叶锈基因Lr35连锁的STS和SCAR 2个标记在F1、F2代植株中标记进行了分析，检测出8个小麦品种含有Lr 35基因。

本研究利用Lr 26、Lr 34和Lr 38 3种抗叶锈病的特异性分子标记，对122份小麦品种（系）的进行分子标记鉴定，以明确这些品种（系）的抗叶锈性，从而填补一些抗叶锈病品种（系）信息的空白，为西南地区小麦品种合理的推广种植提供科学依据，同时为贵州小麦抗叶锈育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试的122份小麦材料均为贵州省旱粮研究所多年收集的育种材料（表2），其中包括本单位自育材料以及通过与全国各育种单位交流学习所得材料。

1.2 引物合成

根据已报道的标记序列［6－8］（表1），由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 DNA的提取

待所有植株长到5叶左右时，用2%CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）提取液提取基因组DNA，具体步骤参照徐如宏等［9］方法，并经过改进。取约0.2g叶片，放入2.0mL的Eppendorf管中经过液氮冷冻后，用研磨棒快速研磨至细粉末，再加入1 000μL左右65℃预 热 提 取 缓 冲 液 （CTAB 2%，Tris－HCl 100 mmol／L，NaCl 1.4mol／L，EDTA 20mmol／L，PVP 1%，β－巯基乙醇1%，pH＝8.0），充分混匀，65℃水浴40min，其间轻轻颠倒2～3次；取出冷却至室温，加等体积氯仿－异戊醇（24∶1）轻轻颠倒混匀10min，10 000 r／min离心10min；取出上清液加2倍体积的预冷（－20℃）无水乙醇沉淀DNA，其DNA用70%乙醇洗2～3次，干燥，用50μL去离子水溶解后保存在－20℃冰箱中备用。用NanoDrop 2 000超微量分光光度计检测DNA浓度，用灭菌ddH2O将终浓度调至50ng／μL，置于4℃冰箱保存备用。

1.4 PCR扩增检测

反应体系10μL，其中含有1×buffer（10mmol／L Tris－HCl，50μmol／L KCl），2.0mmol／L MgCl2，0.2 mmol／L dNTP，上下游引物各0.2μmol／L，50ng模板DNA，0.5UDNA Taq聚合酶。PCR扩增反应程序为94℃预变性5min；94℃变性50s，54～65℃（退火温度因引物而异）退火50s，72℃延伸1min，36个循环；72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染检测。

2 结果与分析

2.1 Lr 26STS标记的特异性检测

用引物IB－267对供试小麦材料进行PCR检测，结果见图1、表2。扩增结果表明，122个小麦材料中有33个品种（系）：黔麦17（L 2）、矮丰66（L 14）、连麦2号 （L 1 5）、驻0 2 6 3－5 4 1（L 2 4）、兴 育9 8 2（L 3 0）、4TH.STEMRRSN 6095（L 35）、西农538（L 45）、新麦06008（L 47）、贵紫1号（L 53）、安2011－2（L 54）、衡5229（L 57）、RWG10Q0159（L 59）、徐麦9169（L 61）、郑麦0943（L 64）、云麦49（L 77）、徐农0189（L 81）、中梁31（L 83）、中梁30（L 84）、滇麦1号（L 89）、郑麦07 H 508（L 96）、洛麦34（L 98）、周麦26（L 99）、周麦27（L 100）、周麦28（L 101）、周麦30（L 102）、周麦32（L 103）、石 H 083－366（L 106）、石 B 11－4098－2（L 107）、济麦31（L 108）、石矮2号（L 113）、中麦69（L 116）、中麦12（L 117）、中麦4044（L 118），可扩增出1条210bp的Lr26特异性DNA条带，与报道片段大小相同，而其它材料中未检测到该条带，初步判断，这32个小麦品种（系）中含有Lr 26基因。

表1 用于抗叶锈基因鉴定的分子标记

图1 部分供试小麦材料Lr 26标记扩增结果

表2 供试122个小麦品种（系）的抗叶锈病分子检测结果

续表1

图2 部分供试小麦材料Lr 34STS标记扩增结果

图3 部分供试小麦材料Lr 38SCAR标记扩增结果

2.2 Lr 34STS标记的特异性检测

用引物csLV 34对供试小麦材料进行PCR检测，结果见图2、表2。在122份供试材料中能扩增出150 bp特异性条带的只有3个：矮丰66（L 14），兴育982（L 30），Q 0159（L 59），因此，可以初步断定这3个品种（系）中含有Lr 34基因。

2.3 Lr 38SCAR标记的特异性检测

用引物Y 38SCAR 982对供试小麦材料进行PCR扩增，结果见图3、表2。如图3所示，扩增得到一条片段大小约为982bp的特异性条带，与报道片段大小相符。检测到该特异性条带的品种（系）有：黔麦17（L 2）、贵农 21（L 8）、矮丰 66（L 14）、连麦 2 号（L 15）、驻0263－541（L 24）、兴育982（L 30）、4TH.STEMRRSN 6095（L 35）、石06－6136（L 39）、西农538（L 45）、新麦06008（L 47）、贵紫1号（L 53）、安2011－2（L 54）、衡 5229（L 57）、Q 0159（L 59）、徐 麦 9169（L 61）、郑麦0943（L 64）、兰天 26（L 69）、云麦 49（L 77）、徐农0189（L 81）、中梁 31（L 83）、中梁 30（L 84）、滇麦1号（L 89）、绵12Z63（L 91）、郑麦07H 508（L 96）、洛麦34（L 98）、周麦26（L 99）、周麦27（L 100）、周麦28（L 101）、周麦30（L 102）、周麦32（L 103）、石 H 083－366（L 106）、石 B 11－4098－2（L 107）、济麦31（L 108）、石矮2号（L 113）、中作硬杆（L 114）、中 H 4058（L 115）、中麦69（L 116），共37个品种可能含有Lr 38基因。

3 讨论与结论

本研究初步明确了122个小麦品种（系）中，3种抗叶锈病基因情况，供试的122份小麦材料中，检测到含有抗叶锈病基因的品种（系）有37个，其中含有Lr 26的有33个，含有Lr 34的有3个，含有Lr 38的有37个；同时含有Lr 26和Lr 38的有30个，同时含有Lr 26、Lr 34和Lr 38的有3个。

含有Lr 26的1B／1R品种在20世纪60年代末至70年代初作为育种材料引进，是垂直抗病性基因，到20世纪80年代具有该血缘的品种逐渐成为我国小麦的主体品种［10］，但是随后新致病小种的出现使得其含有的抗叶锈基因Lr 26失效，导致其后代品种抗性水品下降甚至丧失。该抗性基因单独存在时已经基本失效，但与其它基因组合运用，仍具有一定的抗病价值。Lr 34是目前我国小麦中最重要的抗叶锈病基因之一［4］，是一个典型的慢锈基因，有研究表明，Lr 34在我国农家品种中出现的频率很高［11］，而在本研究的供试小麦材料中检测到该基因的频率很低，说明该抗病基因没有被很好的运用。Lr 34单独应用时仍有一定程度发病［12］，但与其它抗病基因同时运用时，可明显提高其它抗病基因的有效性。Lr 38是一个抗性很强的抗叶锈基因，具有全生育期抗病性，目前我国对其有毒力的致病类型很少，具有较高的利用价值。

利用分子标记可以快速检测出供试材料中所含的抗叶锈病基因类型，在小麦抗病育种方面，可利用分子辅助选择的优势，克服常规杂交育种抗病基因的单一化，聚合多个抗叶锈基因，从而大大提高小麦品种抗病的广谱性和持久性。

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