甘草炮制条件对18α-Gly和18β-Gly含量及比例的影响

赵燕燕，李杨，刘丽艳，柳亚飞，高博

(1.河北大学医学实验中心，河北保定　071000；2.河北大学化学与环境科学学院，河北保定　071002；

3.河北大学临床医学院，河北保定　071000)

甘草炮制条件对18α-Gly和18β-Gly含量及比例的影响

赵燕燕1,2，李杨2，刘丽艳1，柳亚飞2，高博3

(1.河北大学医学实验中心，河北保定071000；2.河北大学化学与环境科学学院，河北保定071002；

3.河北大学临床医学院，河北保定071000)

摘要：研究甘草在炮制过程中不同炮制条件对甘草中主成分差向异构体18α-甘草酸(18α-Gly)和18β-甘草酸(18β-Gly)及杂质含量和比例关系变化的影响及其变化规律.采用Durashell -C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以0.01 mol/L高氯酸铵(氨水调节pH至8.20)-甲醇(体积比为48∶52)为流动相，流速0.80 mL/min，检测波长254 nm，柱温50 ℃，进样量10 μL.观察炮制时间、炮制温度对甘草饮片中主成分和杂质的含量及对甘草酸2个差向异构体比例的影响.经炮制后的甘草主成分总含量较甘草饮片均有所下降，炮制时间的延长会使甘草饮片主成分的损失量逐渐增加，但对甘草饮片中主成分异构体18α-Gly和18β-Gly的比例关系无影响.当炮制温度小于90 ℃时，炮制温度和炮制时间对甘草饮片中的主成分异构体(18α-Gly和18β-Gly)和杂质含量的影响不明显；当炮制温度达到140 ℃后，炮制时间的延长会使18α-Gly和18β-Gly分解，主成分含量显著降低.甘草的主成分和杂质对各炮制因素具有一定敏感性，可考虑作为炮制程度的一个辅助质量指标引入甘草质量控制体系.

关键词：甘草；炮制条件；甘草酸；差向异构体；变化规律

DOI：10.3969/j.issn.1000-1565.2015.02.006

中图分类号：O657.7；R9

文献标志码：志码：A

文章编号：编号：1000-1565(2015)02-0138-09

收稿日期:2014-09-20

基金项目：河北省自然科学基金资助项目(H2013201203)；河北大学医学学科专项建设资金资助项目(2014A1003)

Abstract:To study the effects and change rule of licorice processing conditions on the content and proportion of the principal component isomer 18α-glycyrrhizic acid(18α-Gly) and 18β-glycyrrhizic acid (18β-Gly)，and on the content of impurity during processing. The assay was carried out on a Durashell-C18 column(250 mm×4.6 mm，5 μm) with 0.01 mol/L ammonium perchlorate(the pH value was adjusted to 8.20 with ammonia)-methanol(the volume ratio is 48∶52) as mobile phase at a flow rate of 0.80 mL/min，and the detection wavelength was set at 254 nm. The column temperature was 50 ℃ and the injection volume was 10 μL. Effects of processing time，processing temperature on the content of principal component and impurity，and on the proportion of principal component isomer were observed. Compared with licorice pieces，the total content of principal component were declined after processing. The loss of the principal component in licorice pieces were gradually increased with the extended processing time. But the proportion of principal component isomer 18α-Gly，18β-Gly remained constant. When processing temperature below 90 ℃，the effects of processing time，processing temperature on the content of the principal component and impurity in licorice pieces was not obvious. When heated to 140 ℃，the degradation of 18α-Gly，18β-Gly occurred with the extended processing time，and the content of principal component decreased significantly. The proportion of the principal component in licorice pieces was not affected by the processing time and the processing temperature. The principal component and impurity in licorice pieces were sensitive to each processing factor，which could be part of the scientific evidences for completing quality control system of licorice.

Effects of licorice processing conditions on content and proportion of

18α-glycyrrhizic acid and 18β-glycyrrhizic acid

ZHAO Yanyan1,2，LI Yang2，LIU Liyan1，LIU Yafei2， GAO Bo3

(1.Experimental Center of Medicine，Hebei University，Baoding 071000，China；2.College of Chemistry and

Environmental Science，Hebei University，Baoding 071002，China；3.College of Clinical Medicine，

Hebei University，Baoding 071000，China)

第一作者:赵燕燕(1960-)，女，天津人，河北大学教授，博士，主要从事药学以及将现代分离技术用于临床、药学、食品、环境等方面的研究工作.E-mail：zhaoyany606@tom.com

Key words: licorice；processing conditions；glycyrrhizic acid；isomer；change rule

甘草在中国产区辽阔，产量巨大，具有多种药理作用[1-3]，主要以饮片形式出口并应用于临床.中药炮制是中国人民在数千年的医疗实践中不断总结、改进、发展形成的一套传统制药技术，和中药复方一起构成了中国医药学的2大鲜明特色.中药炮制品作为中药的重要组成部分，广泛应用于医院、药房以及制剂生产中.但目前中药炮制工艺参数缺乏统一的量化标准，造成各地制法不一，导致所含化学成分的性质和含量产生不同程度的改变，使药理作用与毒性、临床疗效也会随之发生变化，直接影响中医临床用药的安全性和有效性[4-5].

甘草酸2个差向异构体虽然在自然界、制剂中或在体内很难发生差向异构化，但在一定的化学条件下能发生构型的改变，李立威等[6]将18β-甘草酸盐经碱液处理后再酸化转化为18α-甘草酸，Ignatov等[7]将18β-甘草酸与甲醇在盐酸酸性条件下作用，再经苯甲酯化，其产物经分离后在碱性条件下水解可得18α-甘草酸.二者构型发生异构化后，在理化性质、药效学、药动学及不良反应等方面均产生显著差异[8-9]，可能会影响药物的作用性质、作用强度和安全性，以及治疗效果或与其他药物的相互作用[10].2010版《中国药典》规定，按干燥品计算，甘草药材中甘草酸的含量不得低于2.0%，但炮制对甘草酸含量及18α-Gly与18β-Gly比例有何影响，药典中未做明确规定.目前， 国内外相关领域在中药甘草的炮制方面没有完整系统的研究[5,11-12]，使得甘草的炮制工艺缺乏准则，难以控制其质量和用量.现有检测方法[13-14]均以甘草酸单体总含量为评价指标，而对甘草酸提取物中18α-Gly和18β-Gly的准确定量分析，以及炮制方法对18α-Gly和18β-Gly异构体比例的影响等方面的研究，尚未见相关文献报道，造成产品内在质量控制的缺失，有待进一步研究.本实验以18α-Gly 和18β-Gly的含量为评价指标，采用RP-HPLC法，同时对甘草饮片中主成分18α-Gly和18β-Gly及杂质进行了含量测定，并对甘草饮片和不同条件下的炮制品进行比较，考察炮制时间和炮制温度对标准品混合物和甘草饮片中主成分和杂质的含量，以及对18α-Gly与18β-Gly比例变化的影响，为甘草质量标准的制定和炮制工艺规范化提供依据.

1实验部分

1.1　仪器与试剂

LC-10ATvp高效液相色谱仪(日本岛津公司)、SPD-M10Avp二极管阵列检测器(DAD)、CLASS-VP工作站；AUW120D十万分之一电子分析天平(日本岛津公司)；超纯化水机(重庆颐洋企业发展有限公司)； DELTA-320型酸度计(梅特勒-托利多仪器有限公司)；KQ5200E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；SK-1快速混匀器(常州国华电器有限公司)； TGL-16G型台式离心机(上海安亭科学仪器厂)、RT-9型中药粉碎机(浙江省缙云县超力机械厂)孔径0.45 mm标准检验筛(浙江上虞市道墟张兴纱筛厂).

18α-Gly标准品(批号：10B001S，ALPS制药)、18β-Gly标准品(批号：05C11S，ALPS制药)、杂质A标准品(批号：10B002S，ALPS制药)、杂质B标准品(批号：10B003S，ALPS制药)、甘草原药材和甘草饮片来源于安国中药材市场(经我校生药学教研室专家鉴定，产地：甘肃，批号：20121229)、炼蜜、高氯酸铵(分析纯).甲醇(色谱纯，天津市康科德科技有限公司).水为二次去离子水.

1.2　色谱条件

色谱柱Durashell -C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为0.01 mol/L高氯酸铵(氨水调节pH至8.20)-甲醇(体积比为48∶52)，流速0.80 mL/min，检测波长254 nm，柱温50 ℃，进样量10 μL.

1.3　方法学考察

1.3.1线性关系和检出限

精密吸取18α-Gly、18β-Gly、杂质A和杂质B标准品储备液各1 mL，分别置于10 mL容量瓶中，用流动相定容至刻度，摇匀，得质量浓度为100 μg/mL标准品溶液，用流动相逐级稀释成一系列质量浓度不同的溶液(100.0，50.0，25.0，10.0，5.0，1.0，0.5，0.1 μg/mL)，按照“1.2”项下色谱条件上机分析，记录色谱图，以进样质量浓度(X)(μg/mL)对峰面积(Y)作图，绘制标准曲线.按3倍信噪比计算检出限.

1.3.2精密度、重复性、稳定性和回收率

量取标准品溶液，按照“1.2”项下色谱条件进行分析，连续进样6次，以峰面积为指标计算18α-Gly、18β-Gly、杂质A、杂质B 4个化合物的RSD(n=6)，考察方法的精密度.取同一批次的甘草饮片溶液6份，按“1.2”项下色谱条件进行分析，以峰面积值为指标计算4个化合物的RSD(n=6)，考察方法的重复性.取同一批次的甘草饮片溶液，按照“1.2”项下色谱条件上机分析，分别在0，1，3，5，7，10 d时进行测定，以峰面积为指标计算4个化合物的RSD(n=6)，考察甘草饮片的稳定性.精密量取甘草饮片溶液、蜜炙甘草溶液各9份，每份10 mL，按甘草饮片溶液、蜜炙甘草溶液中各待测浓度的80%，100%，120%分别加入18α-Gly、18β-Gly、杂质A和杂质B标准品各3份，按“1.2”项下色谱条件上机分析，记录色谱图，考察方法的加样回收率(n=3).

1.4　标准品溶液制备

1.4.1标准品溶液

精密称定18α-Gly、18β-Gly、杂质A和杂质B标准品适量，分别置于10 mL容量瓶中，体积分数为50%甲醇溶解、定容，分别配制成质量浓度为1 mg/mL的标准品储备液，于4 ℃冰箱中保存备用.

精密量取适量标准品储备液于10 mL容量瓶中，体积分数为50%甲醇溶液定容，作为标准品溶液.分别精密量取各标准品储备液适量，置于同一容量瓶中，用流动相定容，摇匀，得混合标准品溶液.

1.4.2标准品混合物

精密称定18α-Gly、18β-Gly、杂质A和杂质B标准品适量，其中18α-Gly和18β-Gly的质量比为1∶15，将4种物质混合均匀，得标准品混合物.

1.5　样品处理

1.5.1标准品混合物

精密称定标准品混合物适量，分别置于称量瓶中，分别在不同温度(40，60，90，140 ℃)下烘制不同的时间(0.25，0.5，1，2，4 h)，待标准品混合物冷却至室温后，精密称定等量的炮制后的粉末20份，分别置于25 mL容量瓶中，加入流动相溶解，冷却至室温后，用流动相定容至刻度，摇匀，作为标准品混合物储备液，于4 ℃冰箱中保存.

精密量取标准品混合物储备液适量，分别置于10 mL容量瓶中，流动相定容，摇匀，作为标准品混合物溶液(质量浓度为50 μg/mL).

1.5.2甘草饮片

根据2010版《中国药典》(一部)(附录Ⅱ D)中蜜炙法所记载的闷润方法对甘草饮片进行闷润，即先将炼蜜加适量沸水(质量分数约10%)稀释后，加入甘草饮片拌匀(每100 kg甘草饮片用炼蜜25 kg)，闷透.单层铺于搪瓷盘中，分别在不同温度下炮制不同时间，取出，用中药粉碎机粉碎，过孔径0.45 mm筛.

取甘草饮片粉末0.15 g，以及相当于0.15 g甘草饮片的蜜炙甘草粉末，分别置于25 mL容量瓶中，精密加入25 mL流动相，称定质量，超声处理40 min[15]，冷却至室温，再称质量，补足损失质量.摇匀、离心，取上清液，用0.45 μm微孔滤膜过滤，作为甘草饮片溶液和蜜炙甘草溶液.

2结果

2.1　专属性实验色谱

分别量取混合标准品溶液、甘草饮片溶液、甘草饮片中加入混合标准品溶液、蜜炙甘草溶液、以及蜜炙甘草中加入混合标准品溶液.按照“1.2”项下色谱条件上机分析，专属性实验色谱图见图1.

1.杂质A；2. 18α-甘草酸；3. 18β-甘草酸；4.杂质B.a.混合标准品溶液；b.甘草饮片溶液；c.甘草饮片中加入混合标准品溶液；d.蜜炙甘草溶液；e.蜜炙甘草中加入混合标准品溶液　图1　专属性实验色谱　Fig.1　HPLC chromatograms of specificity tests

2.2　主成分异构体及其与杂质同时分离检测

2.2.1线性关系和检出限

对18α-Gly、18β-Gly、杂质A和杂质B的线性关系及检出限的考查结果表明，18α-Gly、18β-Gly、杂质A和杂质B的线性回归方程为Y=7.069×103X+4.668×103(r=0.999 9)、Y=7.736×103X-4.030×103(r=0.999 9)、Y=1.413×104X-6.727×103(r=0.999 9)和Y=1.202×104X-5.002×103(r=0.999 9).待测物质量浓度在1.00~1.00×102μg/mL内线性关系均良好，检出限分别为0.30，0.30，0.25，0.25 μg/mL.

2.2.2方法学考察

对精密度、重复性、稳定性和回收率方法学考察结果表明，18α-Gly、18β-Gly、杂质A和杂质B色谱峰峰面积的RSD值均小于1.85%，甘草饮片溶液在10 d内检测稳定性良好，2010版《中国药典》规定，高效液相色谱法RSD应小于2%，考察结果符合药典要求，加样回收率见表1.

表1　甘草饮片中主成分及杂质的加样回收率(n=3)

2.3　不同炮制条件下的含量测定

取标准品溶液，按照“1.2”项下色谱条件上机分析，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的25%.分别取标准品混合物和甘草饮片，按“1.5”项下方法进行炮制，按照“1.2”项下色谱条件上机分析，记录色谱图至主峰保留时间的3倍，分别计算几种待测成分的含量.在不同炮制条件下，标准品混合物和甘草饮片中各成分百分含量见表2.

表2　在不同炮制条件下标准品混合物和甘草饮片中各成分质量分数(n=3)

续表2

在标准品混合物和甘草饮片中，实验测得的18α-Gly与18β-Gly的质量比分别为1∶15和1∶7.

2.4　炮制条件对各成分含量及18α-Gly、18β-Gly比例的影响

2.4.1炮制时间对标准品混合物和甘草饮片中各成分含量及18α-Gly和18β-Gly比例关系的影响

同一温度不同时间点标准品混合物和甘草饮片中18α-Gly和18β-Gly质量分数与比例关系分别见图2a、图2b，其他杂质(杂质A、杂质B及其他杂质)质量分数见表2.标准品混合物实验结果表明，在相同温度点，随着炮制时间的延长，18α-Gly和18β-Gly的含量逐渐降低，杂质A和杂质B含量逐渐升高.当炮制温度小于90 ℃时，在同一温度点，炮制时间对18α-Gly和18β-Gly、杂质A和杂质B含量的影响不明显；随着炮制时间的延长，18α-Gly和18β-Gly的损失量，以及杂质A和杂质B的增加量基本相同，仅在2.85%左右，没有其他杂质生成.当炮制温度达到140 ℃后，随着炮制时间的延长，加速18α-Gly和18β-Gly分解，含量显著降低至20%以上；杂质A和杂质B的含量基本保持不变，其他杂质的生成量随之增加.

甘草饮片中甘草酸主成分的质量分数为2.94%，经炮制后的样品主成分总含量较炮制前均有所降低.同一温度点，随着炮制时间的延长，甘草酸主成分异构体总含量逐渐减少，杂质A和杂质B的百分总含量逐渐增加.与炮制时间对标准品混合物的影响相似，当炮制温度小于90 ℃时，在同一温度点，炮制时间对甘草饮片中的主成分异构体(18α-Gly和18β-Gly)和杂质A、杂质B含量的影响不明显；当炮制温度达到140 ℃后，炮制时间的延长会使18α-Gly和18β-Gly分解加快，主成分含量显著降低.

同一温度点，炮制时间对标准品混合物和甘草饮片中主成分异构体18α-Gly和18β-Gly的比例关系无影响.

a　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　b　图2　同一温度不同时间点标准品混合物(a)和甘草饮片(b)中18α-Gly和18β-Gly质量分数与比例关系　Fig.2　Mass fraction and proportion of 18α-Gly and 18β-Gly in mixture of standard substances and licorice pieces under different time at the same temperature

2.4.2炮制温度对标准品混合物和甘草饮片中各成分含量及18α-Gly和18β-Gly比例关系的影响

同一时间不同温度点标准品混合物和甘草饮片中18α-Gly和18β-Gly质量分数与比例关系分别见图3a、图3b，其他杂质(杂质A、杂质B及其他杂质)质量分数见表2.标准品混合物实验结果表明，在同一时间点，随着炮制温度的升高，18α-Gly和18β-Gly的含量逐渐降低，杂质A和杂质B含量逐渐升高.当炮制温度小于90 ℃时，随着炮制温度的升高，18α-Gly和18β-Gly的损失量和杂质A、杂质B的增加量仅在3.27%左右，没有其他杂质生成，说明炮制温度对含量变化影响不明显；当炮制温度达到140 ℃后，18α-Gly和18β-Gly的含量显著降低，杂质A和杂质B含量升高，并有其他杂质的生成.

a　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　b　图3　同一时间不同温度点标准品混合物(a)和甘草饮片(b)中18α-Gly和18β-Gly质量分数与比例关系　Fig.3　Mass fraction and proportion of 18α-Gly and 18β-Gly in mixture of standard substances and licorice pieces at different temperature under the same time

甘草饮片实验结果表明，在同一时间点，随着炮制温度的升高，甘草饮片主成分的含量逐渐降低，当炮制温度达到140 ℃后，18α-Gly和18β-Gly的含量降低更加显著，与炮制温度对标准品混合物的影响相似.

同一时间点，炮制温度对标准品混合物和甘草饮片中主成分异构体18α-Gly和18β-Gly的比例关系无影响.

3讨论

1)为了使测定结果能更准确地反映炮制因素对其成分含量变化的影响，课题组在实验中选用了同一批次、同一产地的甘草饮片，并用18α-Gly、18β-Gly、杂质A和杂质B的混合标准品进行同步的模拟实验.研究结果表明，甘草在炮制过程中，炮制时间的延长和炮制温度的升高均会导致甘草饮片中主成分异构体18α-Gly和18β-Gly的部分分解，其总含量较甘草饮片有所降低.但炮制过程中未发现主成分异构体的构型转变，同时，不影响二者的比例关系.对于生成的其他杂质，在临床应用中是否会使其药效发生改变或引起毒性反应，还需要做进一步的研究.

2)甘草饮片相对于原药材，要经过洗、晾、晒、润、切等炮制过程，使18α-Gly和18β-Gly含量有所降低.因此对于甘草以原药材入药的，收获后，不可暴晒；炮制过程中不可温度过高或时间过长，以免有效成分过度丢失.采用烘制法炮制时，烘制温度60 ℃，烘制时间1~2 h较为适宜.该炮制条件克服了传统方法中火候难以控制、质量稳定性差、劳动强度大等缺点，具有便于操作、温度和时间可控，外观性状和内部质量较好，质量稳定性好、便于贮存等优势，同时无污染，适于工业化生产，效率较高、经济环保.

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(责任编辑：梁俊红)