p53突变型结直肠癌组织中miR-4484的表达变化及意义

王新，耿文文，毕冬松(沂南县人民医院，山东沂南7600;山东大学齐鲁医院青岛院区;山东大学齐鲁医院)

p53突变型结直肠癌组织中miR-4484的表达变化及意义

王新1，耿文文2，毕冬松3
(1沂南县人民医院，山东沂南276300;2山东大学齐鲁医院青岛院区;3山东大学齐鲁医院)

摘要:目的观察p53野生型和p53突变型结直肠癌组织中微小RNA-4484(miR-4484)的表达及转染抗miR-4484后癌细胞增殖的变化。方法采用实时定量PCR方法检测p53野生型和突变型结直肠癌组织及癌旁组织中miR-4484的表达;将抗miR-4484和空载体分别转入p53野生型结直肠癌细胞HCT116和p53突变型结直肠癌细胞HT29中，采用MTT法检测细胞增殖情况。结果p53突变型、野生型结直肠癌组织中miR-4484高表达者分别占68.1%、14.4%，二者比较P＜0.05。转染抗miR-4484后，HCT116细胞OD值无明显变化(P＞0.05)，HT29细胞OD值显著下降(P＜0.05)。结论p53突变型结直肠癌组织中miR-4484呈高表达，转染抗miR-4484可抑制HT29细胞增殖，miR-4484可能成为p53突变型结直肠癌的治疗靶点。

关键词:肠肿瘤;结直肠癌;微小RNA-4484; p53突变;细胞增殖

结直肠癌是常见的胃肠道恶性肿瘤。p53是目前研究最广泛的抑癌蛋白，已用于肿瘤常规病理检查，p53突变提示患者预后较差。miRNA是生物体内的非编码RNA分子，通过参与细胞增殖、分化以及凋亡等多项生命活动调控生物体的发育、衰老及肿瘤发生等一系列生理病理过程［1］。有研究发现，miRNA与结直肠癌的发生发展密切相关［2～5］。2014年6月～2015年2月，我们检测了p53野生型与p53突变型结直肠癌组织中miR-4484的表达，观察癌细胞转染抗miR-4484后细胞增殖的变化，探讨其临床意义。

1　资料与方法

1.1临床资料选取191例结直肠癌患者，男117例、女74例，年龄40～60岁，TNM分期T1～T3期。均行手术切除，病理检查确诊。其中p53阴性(野生型)97例，p53阳性(突变型)94例。野生型中复发7例，远处转移38例;突变型中复发12例，远处转移49例。

1.2相关指标观察

1.2.1miR-4484检测采用实时定量PCR方法。取结直肠癌组织及癌旁组织各0.5 g，加入TRIzol提取miRNA，紫外分光光度计测其浓度。取2 μg模版RNA，逆转录成cDNA。以cDNA为模版进行PCR扩增。反应条件: 95℃3min预热，95℃12 s、62℃40 s共40个循环。以U6作为内参，使用实时定量PCR仪进行扩增。应用2－ΔΔCt法计算表达量。以肿瘤组织相应的癌旁组织miRNA表达量作为标准，判定肿瘤组织中miRNA的表达水平高低。

1.2.2细胞增殖检测将p53野生型结直肠癌细胞株HCT116及p53突变型结直肠癌细胞株HT29分别加入含10%胎牛血清的DMEM培养基、DMEM/F12培养基中，37℃、5% CO2培养箱中培养。取对数生长期HCT116和HT29，分别用DMEM培养基、DMEM/F12培养基配制成浓度2×104/mL的细胞悬液，以100 μL/孔接种于96孔板，37℃、5% CO2培养箱培养18～24 h。按照Lipofectamine 2000说明书步骤将抗miR-4484和空载体分别转入HCT116和HT29中，采用MTT法检测细胞增殖情况，用酶标仪测定波长490 nm处的OD值，连续观察5d。

1.3统计学方法采用SPSS13.0统计软件。计量资料以珋x±s表示，比较采用χ2检验;计数资料的比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1野生型与突变型结直肠癌组织中miR-4484表达比较97例p53野生型结直肠癌组织中，miR-4484高表达14例(14.4%)、低表达83例(85.6%); 94例p53突变型结直肠癌组织中，miR-4484高表达64例(68.1%)、低表达30例(31.9%)。p53野生型与突变型miR-4484高表达率比较差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.2野生型与突变型结直肠癌细胞增殖情况比较见表1。

表1　HCT116和HT29细胞增殖的OD值比较()

表1　HCT116和HT29细胞增殖的OD值比较()

注:与转染空载体比较，*P＜0.05。

细胞类型OD 值第2天　　第3天　　第4天　　第5天HCT116转染空载体　0.033±0.003 0.058±0.007 0.096±0.002 0.209±0.008转染抗miR-4484 0.033±0.002 0.068±0.003 0.119±0.003 0.244±0.007 HT29转染空载体　0.045±0.002 0.078±0.009 0.159±0.008 0.321±0.011转染抗miR-4484 0.027±0.002 0.045±0.004*0.078±0.009*0.151±0.007*

3　讨论

研究发现，miRNA在人类多种肿瘤的发生、发展中具有重要作用［6］。miRNA能够特异性识别靶基因的mRNA并与之结合，从而干扰mRNA的翻译，促进mRNA降解［7］，具有与抑癌基因相似的作用，能够调节肿瘤的发生发展［8］;另一方面，miRNA也受到其他分子的精细调控，以发挥其正常生理功能［9］。研究发现，miRNA相关基因可作为预测结直肠癌患者的治疗反应及预后的标志［10～12］。p53是重要的抑癌基因，参与多种基因的转录调控［13］。p53突变是人类结直肠癌细胞常见的突变类型，p53突变往往提示结直肠癌恶性程度较高，预后较差［14］。本研究结果显示，p53野生型结直肠癌组织中miR-4484高表达率显著低于p53突变型。提示miR-4484表达与p53基因状态有关，其表达可能受到p53的负向调节，miR-4484可能成为p53突变型结直肠癌的治疗靶点。

为了进一步明确miR-4484对肿瘤增殖的影响，我们检测了miR-4484水平下调时癌细胞的增殖情况。结果显示，转染抗miR-4484的HCT116细胞与转染空载体的HCT116细胞相比，细胞增殖无明显变化，表明miR-4484表达对p53野生型癌细胞的增殖率无明显影响;而转染抗miR-4484的HT29细胞与转染空载体的HT29细胞相比增殖明显下降，表明HT29细胞的增殖与miR-4484表达呈正相关，提示miR-4484可能对p53突变型结直肠癌细胞的增殖具有促进作用。已有研究发现，p53能够通过反馈机制对miRNA的表达水平及功能进行调节［15］，但p53对miR-4484的调节机制是否也依赖于反馈环的形成仍有待研究。p53作为核心抑癌分子，亦有可能通过对miR-4484下游分子通路的抑制发挥其抑癌功能。

综上所述，miR-4484的表达水平及对直结肠癌细胞增殖的作用与p53状态有关，p53可能通过反馈作用负向调控miR-4484的表达，亦可能通过对miR-4484下游通路的负向调控抑制miR-4484的功能，其确切机制有待进一步研究。

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收稿日期:( 2015-04-01)

文章编号:1002-266X(2015)34-0070-02

文献标志码:B

中图分类号:R735.3

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.34.031