紫草素诱导甲状腺髓样癌TT细胞自噬的实验研究

唐旭霞叶再元

紫草素诱导甲状腺髓样癌TT细胞自噬的实验研究

唐旭霞1叶再元2

目的探讨紫草素能否诱导甲状腺髓样癌细胞发生自噬。方法采用透射电镜观察不同浓度紫草素对甲状腺髓样癌TT细胞发生自噬的形态。利用Western-blot分析紫草素作用甲状腺髓样癌TT细胞后自噬标志物Beclin-l和LC3蛋白的表达，利用荧光显微镜观察自噬标记蛋白LC3-Ⅱ的点状聚集情况。结果不同浓度紫草素作用24～72h对TT细胞均有自噬现象发生。2μg/mL、4μg/mL紫草素处理组作用24h后透射电镜观察TT细胞自噬的形态，发现TT细胞出现典型的自噬囊泡：双层膜包绕的圆形或椭圆形结构。紫草素处理自噬相关基因Beclin-l的表达明显低于空白对照组，参与自噬降解的p62表达水平下降，其下降水平与剂量呈相关性，自噬标记蛋白LC3-Ⅱ的表达明显提高。将TT细胞转染GFP-LC3质粒24h后,用紫草素处理24h,于荧光显微镜下观察，处理组与空白对照组相比,胞浆上出现大量的LC3-Ⅱ点状聚集。结论紫草素能诱导甲状腺髓样癌TT细胞发生自噬，透射电镜下可见自噬体，荧光显微镜下可观察到自噬特异性蛋白LC3-Ⅱ。紫草素诱导TT细胞自噬,可能与降低自噬抑制基因Beclinl表达水平相关。

甲状腺髓样癌；TT细胞；紫草素；自噬；Beclin-l；LC3

甲状腺髓样癌（medullary thyroid carcinoma，MTC）来源于甲状腺滤泡旁细胞（又称C细胞），约占全部甲状腺恶性肿瘤的5%～10%[1]。MTC属中度恶性肿瘤，发病率女性略多于男性。近年来，天然药物在肿瘤治疗的过程中发挥着重要的作用，目前发现许多天然药物单体化合物如紫杉醇、苦参碱等都具有较好的抗肿瘤作用[2]，寻找新的MTC新的治疗靶点积极寻求对治疗有效的药物无疑具有重大意义。紫草为紫草科多年生草本植物新疆紫草干燥根，在我国有悠久的药用历史。紫草素具有抗肿瘤效果，对HL60人早幼粒细胞白血病细胞系[3]、肝癌[4-8]等均有作用，不仅能影响肿瘤细胞的代谢、增殖、分化、信号传递、基因表达等过程以阻碍肿瘤细胞的生长[9]，还可以增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，有望成为有效的化学增敏剂。文献报道，紫草素在诱导肿瘤细胞死亡多通过细胞凋亡，也有报道是通过非凋亡途径诱导细胞死亡，即自噬和坏死样程序性死亡[10-11]。本课题组前期研究发现紫草素对TT细胞有明显的细胞毒作用，其表现为通过凋亡和自噬途径诱导肿瘤细胞死亡。本实验采用透射电镜、荧光显微镜和Western-blot等技术，阐述紫草素诱导细胞自噬的作用及可能的机制。

1 实验材料

1.1 材 料 人甲状腺髓样癌TT细胞株购于中国科学院上海细胞生物学研究所。

1.2 药物及试剂 紫草素购自Sigma公司，鼠抗人β-actin抗体、抗人多克隆抗体Beclin-l均购自美国Santa Cruz Biotechnology公司，抗人鼠单克隆抗体LC3购自美国Abcam公司。

2 实验方法

2.1 甲状腺髓样癌TT细胞培养与传代 人甲状腺髓样癌TT细胞为贴壁生长细胞。在37℃、5%CO2饱和湿度条件下，将TT细胞置于F-12K培养液中培养。取对数生长期细胞用于后续实验。

2.2 透射电镜样品制备与观察细胞自噬 取对数生长期细胞，以100×104个细胞浓度接种24h后进行加药处理。空白对照组细胞（仅加入RPMI 1640液）和处理组（以浓度为2、4μg/mL的紫草素处理TT细胞）24h细胞分别经温PBS液洗涤，胰酶消化细胞并离心，细胞沉淀用2%戊二醛4℃预固定，然后用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品，用1%锇酸溶液固定，0.1M，pH7.0磷酸缓冲液漂洗样品，梯度浓度（包括50%，70%，80%，90%，95%和100%）的乙醇溶液及纯丙酮对样品进行脱水处理。用包埋剂与丙酮的混合液处理渗透、包埋、超薄切片，切片用柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液各染色，采用日本JEOL公司JEM-1230型透射电镜观察。

2.3 Western-blot检测自噬标志物Beclin1和LC3蛋白的表达 分别将2μg、4μg紫草素作用24h的TT细胞用预冷的PBS洗涤，6孔板各加入细胞组织裂解液（RIPA）100μL，加入3种蛋白酶抑制剂（pepstatin A、aprotinin、leupeptin）各0.5μL，收集细胞后冰浴、离心、取上清，测BCA法测定蛋白质浓度。取80μg等量的蛋白质液加入SDS聚丙烯酰胺凝胶各胶孔中电泳，获取滤膜，并转移到丽春红工作液中染色，去离子水漂洗PVDF膜至丽春红脱色。5%脱脂奶粉/PBS（封闭液）封闭2h。兔抗人actin、Beclin-I和LC3多克隆抗体用封闭液稀释，4℃孵育过夜。5%脱脂奶粉TBST洗涤3次，加封闭液稀释的羊抗兔辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，室温孵育2h。TBST洗涤3次，加ECL试剂，室温孵育，在暗盒中覆盖X线摄影胶片曝光。剪切曝光显影的目的条带胶片经扫描、编辑后输出。

2.4 荧光显微镜观察GFP-LC3的点状聚集 将处理好的玻片置于24孔板中，取处于对数生长期的HeP3B细胞，稀释成2.0×105个/mL，并培养，每孔0.5mL，细胞贴壁后，转染GFP-LC3质粒，24h后，加入2μg/mL、4μg/mL紫草素处理细胞24h，用PBS洗涤，荧光显微镜下观察拍照。

3 实验结果

3.1 透射电镜样品制备与观察TT细胞自噬的形态

透射电镜观察，2μg/mL、4μg/mL紫草素处理组作用24h后细胞凋亡的形态呈典型自噬的细胞形态改变，即双层膜包绕的圆形或椭圆形结构，同时可见自噬小体，见图1（封三）。

3.2 Western-blot检测自噬标志物Beclin-I和LC3蛋白表达 紫草素处理各组自噬标记性蛋白自噬相关基因Beclin-1表达明显低于空白对照组，参与自噬降解的p62表达水平下降，其下降水平与剂量呈相关性，和LC3的表达明显上升提示紫草素诱导自噬的发生，见图2（封三）。

3.3 荧光显微镜观察GFP-LC3的点状聚集 将TT细胞转染GFP-LC3质粒24h，用紫草素处理24h后于荧光显微镜下观察，与对照组相比，4μg/mL紫草素组胞浆上出现大量的LC3点状聚集，提示紫草素可以诱导TT细胞发生自噬，见图3（封三）。

4 讨论

肿瘤细胞的死亡方式主要有三种：坏死（necrosis）、凋亡（apoptosis）、自噬（autophagy）。其中自噬是现今研究比较热门的一种程序性死亡方式，广泛存在于真核细胞中的生命现象，是生物在其发育、老化过程中都存在的一个净化自身多余或受损细胞器的共同机制。生命体籍此维持蛋白代谢平衡及细胞环境稳定,这一过程在细胞清除废物、结构重建、生长发育中起重要作用[12]。自噬细胞在一定的胁迫因素如饥饿、外力损伤等刺激下可发生自噬，其典型形态学特征包括细胞质内出现多个具有双层膜结构的自噬小泡[11]，随后与溶酶体结合并被降解。适度的自噬被认为是细胞耐受周围不良生存环境的一种适应方式，但过度的自噬行为将导致细胞死亡。

自噬的整个过程受基因调控，但到目前为止，其调控机制尚未研究清楚。研究表明，一般抑癌基因可诱导自噬，而癌基因则抑制自噬。mTOR和BeclinlhVPs34是自噬调控的中心[13-14]。自噬主要受两个复合体的调节，即mTOR复合体和Beclin-I复合体。mTOR通路的激活则抑制自噬的发生，而Beclin-I复合体可促进自噬的发生。

Idikio[15]在对肿瘤标志物研究中发现，甲状腺癌组织中LC3蛋白高表达，而Beclin-I表达下降。张艳红等[16]应用免疫组化染色法检测78例乳头状甲状腺癌和45例癌旁正常黏膜组织，发现自噬相关基因PTEN和Beclin-l在乳头状甲状腺癌组织中蛋白表达下调，并与肿瘤淋巴结转移有关。另有研究[17-18]表明，虽然在正常甲状腺组织和甲状腺乳头状癌组织中LC3不表达,但是在阿霉素干预后LC3表达明显增高，并提出使用自噬激活剂有可能对常规治疗不敏感的甲状腺癌患者有效。Gundara等[19]对19例甲状腺髓样癌患者的新鲜冰冻进行了分子生物标记物MicroRNAs的检测，结果发现MiRs-183,175有表达增加，MiR-9表达下降；对甲状腺髓样癌TT细胞进行MiRs-183基因敲除后发现LC3表达增高，由此推论可通过增加自噬途径导致细胞死亡。同时也提示通过肿瘤细胞自噬有可能提高对肿瘤细胞的杀伤，为我们治疗甲状腺髓样癌提供了新的治疗思路。

电镜仍是目前检测自噬最经典的方法。正常情况下LC3于胞质中均匀分布。而自噬在细胞学上最主要的特征是细胞内出现大量的双层或多层膜的细胞质囊泡结构[13，20]。本实验以浓度为2、4μg/mL的紫草素处理TT细胞24h，如文中所述步骤固定、脱水、包埋，醋酸双氧铀和柠檬酸铅双染色后，以透射电镜观察示细胞的超微结构可见部分典型的自噬形态：胞质内出现独立双层膜，且大部分呈弯曲或C型，另有一些双层膜已包绕部分胞质或细胞器，甚至部分细胞核，形成封闭的双侧膜囊泡即自噬体，表明紫草素诱导的TT细胞死亡中,有细胞发生了自噬性活化。而空白对照组以0.1%的DMSO处理细胞，未见凋亡或自噬的典型形态。另外，LC3被认为参与自噬体的形成[21]，它与磷脂酞乙醇胺（PE）结合，定位在自噬体外膜上，其含量与自噬泡数量成正比。因此，LC3现已作为自噬体的特异性标记蛋白[22]。应用与绿色荧光蛋白（GFP）结合的GFP-LC3来检测自噬被认为是自噬检测的金标准[23]。在本实验中，经绿色荧光FITC标记自噬特异性蛋白LC3-Ⅱ，可以清楚显示自噬在细胞中的分布，紫草素4μg/mL作用强于2μg/mL，紫草素作用后T细胞胞浆上出现大量的空白对照组没有的点状聚集，证明紫草素可以诱导TT细胞发生自噬。

综上所述，紫草素能诱导甲状腺髓样癌TT细胞发生自噬，可能与降低自噬抑制基因Beclin-l表达水平相关，这将为甲状腺髓样癌的基因治疗提供新思路。随着对自噬研究的不断深入，明确其在甲状腺癌发生发展以及预后的作用，通过调节肿瘤细胞的自噬活性，诱导肿瘤细胞的自噬死亡，在肿瘤的治疗领域具有较好的应用前景。

［1］Raue F，Frank-Raue K.Long-Term Follow-up in Medullary Thyroid Carcinoma［J］.Recent Results Cancer Res，2015，204：207-225.

［2］Wang CY，Bai XY，Wang CH.Traditional Chinese medicine：a treasured natural resource of anticancer drug research and development［J］.Am J Chin Med，2014，42（3）：543-559.

［3］Hashimoto S，Xu M，Masuda Y，et al.beta-hydroxyisovalerylshikonin inhibits the cell growth of various cancer cell lines and induces apoptosis in leukemia HL-60 cells through a mechanism different from those of Fas and etoposide［J］.J Biochem，1999，125（1）：17-23.

［4］Zhu MY，Wang RB，Zhou W，et al.Antitumor effect research progress of shikonin and its derivatives［J］.Yao Xue Xue Bao，2012，47（5）：588-593.

［5］Hsu PC，Huang YT，Tsai ML，et al.Induction of apoptosis by shikonin through coordinative modulation of the Bcl-2 family，p27，and p53，release of cytochrome c，and sequential activation of caspases in human colorectal carcinoma cells ［J］.J Agric Food Chem，2004，52（20）：6330-6337.

［6］Nam KN，Son MS，Park JH，et al.Shikonins attenuate microglial inflammatory responses by inhibition of ERK，Akt，and NF-kappaB：neuroprotective implications［J］.Neuropharmacology，2008，55（5）：819-825.

［7］Min R，Tong J，Wenjun Y，et al.Growth inhibition and induction of apoptosis in human oral squamous cell carcinoma Tca-8113 cell lines by Shikonin was partly through the inactivation ofNF-kappaB pathway［J］.Phytother Res，2008，22（3）：407-415.

［8］ Chang IC，Huang YJ，Chiang TI，et al.Shikonin inducesapoptosis through reactive oxygen species/extracellular signal-regulated kinase pathway in osteosarcoma cells［J］.Biol Pharm Bull，2010，33（5）：816-824.

［9］黄河，刘宗潮.紫草素及其衍生物的抗肿瘤作用［J］.肿瘤防治杂志，2005，12（1）：75-78.

［10］Hu X，Xuan Y.Bypassing cancer drug resistance by activating multiple death pathways--a proposal from the study of circumventing cancer drug resistance by induction of necroptosis［J］.Cancer Lett，2008，259（2）：127-137.

［11］Xuan Y，Hu X.Naturally-occurring shikonin analogues--a class of necroptotic inducers that circumvent cancer drug resistance［J］.Cancer Lett，2009，274（2）：233-242.

［12］Grander D，Panaretakis T.Autophagy：cancer therapy's friend or foe［J］.Future Med Chem，2010，2（2）：285-297.

［13］Xie Z，Klionsky DJ.Autophagosome formation:core machinery and adaptations［J］.Nat Cell Biol，2007，9（10）：1102-1109.

［14］Espona-Fiedler M，Soto-Cerrato V，Hosseini A，et al.Identification of dual mTORC1 and mTORC2 inhibitors in melanoma cells：prodigiosin vs［J］.obatoclax Biochem Pharmacol，2012，83（4）：489-496.

［15］Idikio HA.Galectin-3 and Beclin1/Atg6 genes in human cancers:using cDNA tissue panel，qRT-PCR，and logistic regression model to identify cancer cell biomarkers［J］. Plos One，2011，6（10）：e26150.

［16］张艳红，王桂琴.自噬相关基因PTEN和Beclinl在乳头状甲状腺癌中的表达和意义［J］.临床合理用药杂志，2011，4（3）：34-35.

［17］Lin CI，Whang EE，Abramson MA，et al.Autophagy:a new target for advanced papillary thyroid cancer therapy［J］. Surgery，2009，146（6）：1208-1214.

［18］Lin CI，Whang EE，Donner DB，et al.Autophagy induction with RAD001 enhances chemosensitivity and radiosensitivity through Met inhibition in papillary thyroid cancer［J］. Mol Cancer Res，2010，8（9）：1217-1226.

［19］Gundara JS，Robinson BG，Sidhu SB.Evolution of the"autophagamiR"［J］.Autophagy，2011，7（12）：1553-1554.

［20］Martinez J，Almendinger J，Oberst A，et al.Microtubule-associated protein 1 light chain 3 alpha（LC3）-associated phagocytosis is required for the efficient clearance of dead cells［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2011，108（42）：17396-17401.

［21］Tanida I，Ueno T，Kominami E.LC3 conjugation system in mammalian autophagy［J］.Int J Biochem Cell Biol，2004，36（12）：2503-2518.

［22］Moretti L，Cha YI，Niermann KJ，et al.Switch between apoptosis and autophagy：radiation-induced endoplasmic reticulum stress［J］.Cell Cycle，2007，6（7）：793-798.

［23］Janku F，McConkey DJ，Hong DS，et al.Autophagy as a target for anticancer therapy［J］.Nat Rev Clin Oncol，2011，8 （9）：528-539.

（收稿：2015-11-10 修回：2015-12-30）

Shikonin-induced Autophagy of Human Medullary Thyroid Carcinoma TT Cells

TANG Xuxia1,YE Zaiyuan2.1 Department of Otorhinolaryngology,First Affiliated Hospital of Zhejiang Medical University,Hangzhou(310006), China;2 Department of Surgery,People's Hospital of Zhejiang Province,Hangzhou(310014),China

ObjectiveTo investigate the influence of shikonin on autophagy of human medullary thyroid carcinoma TT cells in vitro.MethodsAfter shikonin treatment,the morphological features of TT cell autophagy was observed by electron microscope;the autophagic markers Beclin-I and LC3 proteins on TT cells was determined with Western Blotting;theLC3-II points was observed byfluorescence microscopy.Results4μg/mL shikonin for 24-72h induced autophagy of TT cells.The TT cells showed typical autophagy cyst with double round or oval shape structures.Compared with control group,the Beclinl gene expression was significantly lower in shikonin-treated group,and the expression of p62 decreased in a dose-dependent manner.The expression of autophagy marker protein LC3-II increased.When the TT cellswere transfected with GFP-LC3 plasmid for 24 hand treated with shikonin for 24h,a large amounts of LC3-II points was seen in shikonin-treated groups by fluorescence microscopy.ConclusionAftershikonin treatment,the autophagosome was seen by electron microscope and the autophagy marker protein LC3-II was found by fluorescence microscope,therefore shikonin was able to induce the autophagy of human medullary thyroid carcinoma TT cells,which may be related with downregulating autophagy suppressor gene Beclin-I.

Medullary carcinoma of thyroid;TT cells;Shikonin;Autophagy;Beclin-l;LC3

浙江省自然基金项目（No.LY13H130003）

1浙江中医药大学附属第一医院耳鼻咽喉科（杭州310006）；2浙江省人民医院外科（杭州 310014）

叶再元，Tel：13355713900；E-mail：zaiyuanye@163.com