禽流感病毒诊断技术的研究进展

石 霖 呼延含蓉

禽流感病毒诊断技术的研究进展

石 霖 呼延含蓉

禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）是一种可以引起人畜共患病的病原，由其引发的禽流感疫情不仅给养禽行业带来了严重的经济损失，而且也给人类健康，甚至生命安全带来了严重威胁。该病至今已经给全球经济和公共卫生带来了严重后果。由禽流感病毒感染的家禽，其临诊症状及剖检的病理变化通常会因感染禽流感病毒毒株的亚型及特点有所差异，其临诊症状也通常因感染家禽的种类、家禽日龄、感染情况及其他环境等不同而表现出不同症状。如高致病性禽流感（HPAI）的临诊症状较为明显，其症状和病理变化对确诊为疑似HPAI病例有一定的参考价值；然而低致病性禽流感（LPAI）感染家禽，其症状往往不明显，有时临诊上难以进行确诊。因此，为了有效地对禽流感病毒进行监测，及时发现流行的毒株从而控制该病毒的传播，还需依赖于能够准确和敏感地检测家禽病原和血清的实验室诊断技术。近年来，国内外已经建立了多种分子生物学及血清学检测禽流感的试验方法。

1 禽流感样本的采集

对于来自活禽的样本主要采集泄殖腔和喉气管拭子，研究表明，泄殖腔和喉气管拭子样品用于检测禽流感病毒的结果准确。将棉拭子插入泄殖腔1.5～2.0cm处，旋转后沾上粪便获得泄殖腔拭子样品；将棉拭子插入口腔至咽的后部直达喉气管，轻轻擦拭并慢慢旋转沾上气管分泌物从而获得喉气管拭子样品。将采集的棉拭子样品置于含有抗生素的PBS离心管中，低温保存。对于病死禽类主要采集其组织样品，每只禽采集肠管及肠内容物各1份，肺脏和气管样品各1份，肝脏、脾脏、肾脏、脑等各1份，做好标记。在特殊条件下，也可以采集禽类的新鲜粪便。采集的病原检测样品应保存于含有抗生素的PBS缓冲液中，加入抗生素的主要目的是消除任何可能干扰后续诊断的细菌。此外，从采集样品开始，现场样本应始终严格保存在低温条件下，切忌频繁的反复冻融，因为这会导致病毒效价的明显降低或者病毒分离的失败。如果采集到的样品不能在短期内进行检测，建议将所有样品保存在-80℃冰箱内。

2 禽流感病毒的分离培养

1933年，科研人员将流感病毒样品接种到10～12胚龄SPF鸡胚羊膜腔中，并首次成功分离，证实鸡胚中的羊膜腔的细胞非常适合流感病毒的增殖。这种使用SPF鸡胚分离禽流感病毒的方法，不仅是诊断禽流感病毒的金标准技术，而且还是可以经过鸡胚接种产生高效价禽流感病毒的方法。目前，除了最近发现的在蝙蝠上分离到的流感病毒H17N10外，几乎所有的流感病毒均可通过该方法进行检测。样品接种SPF鸡胚后，如果没有血凝结，可将收集的尿囊液连续盲传三代后重新检测血凝结后，若仍无血凝结，则可以确定该样品不含禽流感病毒。

然而，使用鸡胚分离禽流感病毒的方法需要连续供应现成的受精鸡胚和培养鸡胚的孵化器设备。为了获得较高的病毒效价，整个病毒分离过程需要花费数天甚至数周，是耗时耗力的诊断方法，如果有疑似HPAI的样品，则必须在生物安全三级实验室内进行操作。因此，鸡胚病毒分离的方法并不被广泛应用于禽流感病毒感染的常规诊断中。但是，该方法可以提供大量的具有传染性的活病毒，因此在研究机构，尤其是禽流感参考实验室可以利用这种培养系统分离培养高效价的病毒，进一步用于病毒的生物学特征研究、致病性研究、传播机制研究等。

19世纪40年代有学者使用细胞进行流感病毒的分离培养，为在鸡胚中不能很好生长的人或猪流感病毒提供了可行的分离培养方法。该方法可培养并且扩增病毒，这种方法比直接检测更灵敏。同时，细胞培养还可以监控细胞病理变化以及在加入红细胞后的红细胞吸附现象。目前，已经有多种哺乳动物和禽类的细胞系被用于流感病毒的分离培养。最常用的细胞主要包括：初级恒河猴肾和恒河猴肾（LLCMK2）细胞、非洲绿猴肾细胞、貂肺上皮细胞系（MvlLu）、水牛绿猴肾细胞、犬肾细胞（MDCK）、绿猴连续细胞系（Vero）、人类肺胚胎细胞（MRC5）、CA-CO-2细胞系、鸭胚胎细胞（CCL-141）、鹅胚肾细胞（CCL-169）、鸭胚成纤维细胞和鸡胚成纤维细胞等。另外，由于病毒缓慢地从感染病毒的细胞表面释放，可以在显微镜下观察到红细胞吸附导致的红细胞直接黏附在这些感染的细胞上。除了鸡胚成纤维细胞外，MDCK细胞目前也被广泛应用于病毒分离系统。然而，由于禽流感病毒依据毒株不同而有不同的宿主和体外繁殖特性，同时不是所有的宿主细胞对所有的禽流感病毒亚型具有耐受性，因此有效的病毒分离只有在细胞培养物对其接种的病毒敏感时才能成功。此外，该方法需要将样品快速地运输到实验室，因为延迟可能导致病毒失活，从而不能做到从任何感染物上分离到病毒。

另一种培养禽流感病毒的有效技术是快速离心培养技术（SVC），该技术是在一个含有盖玻片的瓶中用单一或者混合细胞系培养两种细胞的单层细胞。该方法经过低温离心后，可以增加病毒与细胞接触的概率，再进行培养，孵育24～48h后，对细胞进行荧光抗体染色、检测，灵敏度是传统培养方法的60%以上，该技术的优点是通过离心的方法增强了细胞的病毒感染性，从而提高了检测的灵敏度并缩短了检测时间（缩短到24h），该方法的检测灵敏度与传统的试管培养法相当，但是高于直接荧光抗体检测。

3 禽流感病毒的分子生物学检测技术

分子生物技术又称核酸检测技术，检测病毒核酸，即RNA或者DNA，能够缩短实验室诊断禽流感病毒的周期。目前，已经建立起多种检测禽流感病毒核酸RNA的技术，最常用的是反转录聚合酶链反应（RT-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）。RTPCR将来自于鸡胚、细胞培养液或者临诊组织样品的病毒RNA反向转录cDNA，然后使用禽流感病毒特异性引物扩增该cDNA，根据分子质量不同使用琼脂糖凝胶分离PCR产物，再使用溴化乙啶染色分析PCR产物，这种方法可以用于临诊疑似样品的实验室诊断。其主要缺点是：操作过程中可能产生污染，同时需要进行凝胶电泳与凝胶成像等复杂的操作。

荧光RT-PCR是在此基础上发展起来的，该反应体系除了加入特异性检测引物外，还加入了荧光标记探针，通过荧光PCR仪器实时监测PCR产物的数量，该方法的主要优点为：所需时间短，2～3h即可显示结果，无须凝胶电泳与凝胶成像等后续操作。荧光RT-PCR检测技术是近年来应用较多的分子生物学检测技术，目前已经在省级以上动物疫病诊断机构广泛使用，该方法灵敏、快速，可对禽流感的亚型进行区分。近年来基因芯片技术发展迅速，基因芯片技术是结合一些现代高新技术，把核酸信息按要求固定在某些特定载体上，从而实现对不同生物组的分析和检测，具有高通量、平行性分析、微量化等特点。在禽流感病毒的检测过程中，将反转录的cDNA产物固定于载体上，通过荧光标记的核酸探针与靶分子的杂交，可以区分混合体系中的扩增产物，借此来区分病毒亚型。王秀荣等利用基因芯片区分禽流感病毒H5、H7、H9主要亚型，为禽流感病毒诊断的快速高通量检测奠定扎实的技术基础。2000年诞生的环介导等温扩增反应（LAMP）技术是分子检测技术的又一突破，该方法通过两对引物，利用BstDNA聚合酶的链置换活性提供反应的动力，在恒温条件下完成对核酸的扩增反应。该技术于恒温条件下几十分钟内即可完成，无须昂贵的仪器设备，结果可肉眼直接观察，具有简便、快速、灵敏度高、特异性好等特点，非常适用于基层实验室及大型养殖场的检测。近年来，已有一些成功应用该技术对病原体进行检测的文献报道。

禽流感病毒的分子诊断方法，尤其是荧光RT-PCR检测方法在检疫部门应用较多，该方法具备简便、快速、灵敏的优点，但是也存在分子诊断技术共有的技术问题。其中最重要的是禽流感病毒变异频繁，病毒的基因序列可能产生遗传漂移和转变，如果引物结合位点在内的基因序列发生改变，则该反应将不会扩增已改变的目标序列，使得PCR方法的精准性和特异性受到影响，因此基于核酸的分子检测需要定期根据禽流感的流行情况和变异情况对其引物序列进行更新。除此之外，还有一些因素也可以导致产生假阴性结果，如在准备样品过程中，混在病原体内的抑制物、病毒的效价较低、目标RNA在扩增前出现了降解以及配制反应体系时出现了错误等，其中RNA质量问题是最重要的，使用降解的RNA或无效的PCR反应会使结果不准确。因此，遵循严格的操作程序是非常重要的。

此外，从mRNA到cDNA的互补转变具有高度多样性，选择不同的反转录酶会使RT-PCR结果相差很大。mRNA不是线性分子，而是通过广泛的链内碱基配对形成二级结构，这导致许多由单链环状结构和长度可变的双链发夹结构组成的茎环结构。反转录（Reversed Transcription，RT）步骤的效率在很大程度上依赖用于合成不针对发夹结构的cDNA的引物，因为与核酸分子内杂交（即mRNA与自身）动力相比核酸分子间（即引物与mRNA）杂交动力相对较弱。因此，应选择适合的环状结构的反转录引物而不是茎状结构的引物。同样重要的是，要确保在PCR引物结合位点，扩增子本身没有二级结构，因为在结合位点广泛出现二级结构会产生不同结果。最后，该方法检测只能确定病原体的数量，并不能确定病原体是否具有感染能力。因此，阳性结果不一定能说明会对公共卫生构成了威胁，而是需要进一步的病毒分离培养来确定病毒的活力。

4 禽流感血清学检测技术

在诊断禽类禽流感病毒过程中，血清学诊断方法不仅在监测种群疫病上发挥着重要作用，同时也为禽流感病毒感染的诊断提供了一个精确的方法。血清学诊断对于家禽的LPAI病毒感染有一定的参考价值，而对在HPAI病例中禽类产生抗体前就已经死亡的意义并不大。

（1）血凝和血凝抑制试验：其原理是依据流感病毒表面的HA蛋白可与含有唾液酸的糖蛋白结合，它们之间的结合比较紧密，不经特殊处理，难以分开，这种凝集是不可逆转的。但该凝集可被相应的特异性抗体所抑制，因此血凝试验通常用来进行禽流感病毒的初步检测，检测时间应控制在30min以内，否则易出现假阳性结果。一旦血凝试验呈阳性结果，需要进一步考虑用特异性血清做血凝抑制试验，与新城疫等有血凝活性的病原进行鉴别。血凝抑制试验特异性较好，可以用来确定流感病毒的亚型。

（2）神经氨酸酶抑制试验：该试验是鉴定禽流感病毒NA亚型的主要手段，其不会受到血清中非特异性因素的干扰，有较高准确度，但需要注意，某些NA亚型之间可能会出现交叉反应，HA的抗体也可能对NA产生影响。

（3）酶联免疫吸附试验：该方法是以抗原或抗体固相化以及酶标记技术为基础的，抗原或抗体能在固相载体表面结合且保持原有的免疫学特性，经酶标记后的抗原或抗体复合物既保留了免疫学特性，又具备酶的活性。抗体结合显色后利用酶标仪读取结果，进行判定。ELISA检测方法多种多样，常见的有间接ELISA、竞争ELISA、DOT-ELISA等，该检测技术具有较好的敏感性和特异性，既可以检测抗原又可以检测抗体，是一种快速的临床诊断方法。

（4）病毒中和试验：该方法是较为经典的血清学检测手段，特异性、敏感性都比较好，同时可以测量动物体内中和抗体含量，但由于操作较烦琐、耗时，当涉及具有感染性病毒时需要在生物安全级别较高的实验室操作，这使得该方法几乎不应用于临床快速诊断。

（5）琼脂凝胶扩散试验：根据免疫沉淀原理，抗原和抗体可以通过悬浮的间质扩散到反应区域，当抗原和抗体发生反应时，就会在琼脂糖介质上产生一条白色沉淀线。该方法操作简便、特异性较高，但是敏感性较低，对抗原、抗体要求高，病毒必须经过裂解，故其已经很少使用。

（6）间接免疫荧光试验：该方法使用标记有荧光素的抗原或抗体进行反应来对流感病毒进行鉴定，具有简便易操作、敏感、费用低等特点。

摘自《黑龙江畜牧兽医》2016（05上）