Gremlin在原发性开角型青光眼患者房水及小梁网组织中的表达及意义

Gremlin在原发性开角型青光眼患者房水及小梁网组织中的表达及意义

王 晶 张广斌

目的检测原发性开角型青光眼（Primary Open-angle Glaucoma，POAG）患者房水及小梁网组织中Gremlin的表达。方法取20例POAG患者房水及小梁网组织标本，取18例单纯老年性白内障的房水及5例成年人尸眼的小梁网标本作为对照组。采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定房水中Gremlin的含量，应用免疫组织化学方法检测小梁组织Gremlin的表达。结果POAG患者房水中的Gremlin含量明显高于非POAG患者，差异具有统计学意义（P＜0.05）。POAG患者小梁细胞中Gremlin呈阳性表达，正常人的小梁网组织中Gremlin不表达。结论POAG患者房水及小梁细胞中Gremlin表达明显增加，提示Gremlin在POAG发病中起重要作用。

原发性开角型青光眼；Gremlin；房水；小梁细胞；ELISA；免疫组织化学染色

原发性开角型青光眼（Primary Open-angle Glaucoma，POAG）的确切发病机制仍不十分明确。研究表明，小梁网细胞外基质合成增加，造成小梁网孔狭窄甚至闭塞，房水外排途径受阻是导致眼内压力升高的一个重要原因［1］。Gremlin基因最早从爪蟾中枢神经脊中克隆出来，广泛存在于细胞外、内质网和高尔基氏体中［2］。2015年有学者发现，Gemlin能促进标志性蛋白α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、细胞外基质主要成分纤维连接蛋白（Fn）和Ⅰ型胶原纤维（COL-1）的表达［3］。2007年Robert J等［4］在研究TGF-β和BMP在POAG发病机制中的作用时，意外地发现了BMP拮抗剂Gremlin在体外培养的小梁网细胞中的高表达，并指出Gremlin的这种表达与眼压高低成正相关，揭示了Gremlin在POAG的发生发展中起着重要的作用。本研究通过应用酶联免疫吸附法（ELISA）测定20例POAG患者房水中的Gremlin含量，采用免疫组织化学方法检测小梁网中Gremlin的表达，现将结果报告如下。

1 材料和方法

1.1 实验组标本

选取2007年3～6月于我院住院确诊为原发性开角型青光眼（中期或晚期）需行小梁切除术患者共20例，年龄35～65岁，平均年龄（55.70±6.59）岁。其中男性12例，女性8例。病程＞1年。所有患者均行穿透性小梁切除术，术中穿刺入前房后，抽取0.2～0.4 ml房水，被血液污染的标本弃去，立即置于1.5 ml Eppendorf管中，4℃，12 000 r/min离心15 min，取上清液，置于另一Eppendorf管中，-80℃保存备用。手术切除小梁网，标本立即置入4%多聚甲醛中固定，4℃保存备用。

1.2 对照组标本

选取18例诊断为单纯老年性白内障拟行白内障手术患者，年龄50～65岁，平均年龄（55.39±3.29）岁。排除并发性白内障，排除伴发其他眼部疾病。白内障手术中抽取房水0.2～0.4 ml作为对照组。选取5例成年人尸眼，供体来自于眼库，排除具有眼部疾病或恶性肿瘤患者。死亡4 h内取小梁网标本，固定与保存方法同实验组。

1.3 主要试剂

Gremlin-ELISA试剂盒购自上海麦莎生物科技有限公司，兔抗人Gremlin多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，抗人VEGF抗体、SABC免疫组织化学试剂盒和3，3’-二氨基联苯氨（DAB）显色试剂盒均购自武汉博士德公司。

1.4 操作方法

房水标本严格按照ELISA试剂盒里操作步骤进行，用Tecon酶标仪读取吸光度（A）值，用标准品稀释浓度和A值为坐标绘制曲线，从曲线中查得Gremlin含量（ng/ml）。小梁网标本固定，常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋，连续切片制成5 μm标本。实验组与对照组标本各取2片行常规HE染色，其余切片采用链霉菌亲生物素蛋白—过氧化物酶标法（SP）进行免疫组织化学染色。结果以背景清晰、细胞胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性，无棕黄色颗粒为阴性。

1.5 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料用 （）表示，用两独立样本t检验进行统计学处理，P＜0.05，差异有统计学意义。

2 结果

实验组房水中Gremlin含量（560.02±20.59）ng/ml较对照组房水中Gremlin含量（83.09±10.16）ng/ml增高，P＜0.01，差异有统计学意义。见表1-2。

表2 两组患者的平均Gremlin含量（）

表2 两组患者的平均Gremlin含量（）

组别 Gremlin含量（ng/ml）实验组对照组P 560.02±20.59 83.09±10.16＜0.01

免疫组织化学染色结果：对照组小梁结构完整，小梁网眼疏松，小梁细胞均匀分布，细胞胞浆中未见棕黄色阳性染色。POAG患者小梁网眼变窄或消失，部分纤维化，细胞中含有较多棕黄色颗粒或色素团块，呈不规则分布（图1-2）。

3 讨论

POAG病程长，病情隐匿，易被患者忽视。确诊时视神经和视乳头多已发生不可逆的功能损害，造成视野缺损和视力下降。小梁网细胞外基质（ECM）主要由胶原蛋白、弹性蛋白、纤维连接蛋白及黏多糖组成［5］。一系列生长因子如EGF、TGF-β、MMP等能影响ECM的合成和降解，从而引起ECM的沉积增加，导致孔眼狭窄甚至闭塞，房水外流阻力增大，眼内压升高。Gremlin基因最早从爪蟾中枢神经脊中克隆出来，是骨形态发生蛋白（Bone Morphogenetic，BMP）拮抗剂家族的新成员，包含C端有8个氨基酸环的半胱氨酸重复区域半胱氨酸结，是高度保守的糖化和磷酸化分泌型蛋白［6］。

2007年Robert［4］在研究TGF-β、BMP在POAG发病机制中的作用时，意外地发现在小梁网细胞及房水中BMP拮抗剂Gremlin的表达明显增高。研究显示通过定量PCR检测青光眼模型和正常眼模型小梁网细胞中Gremlin的表达，前者的Gremlin含量为后者的16倍。在体外培养的两组人眼前节模型中，一组在培养液里加入10 mg/ml Gremlin，另一组未添加Gremlin，4 d后对比两组眼内压，前者眼内压显著升高；将Gremlin从培养液中提取弃去，2 d后眼内压有所下降。这一结果不仅提示Gremlin可能参与了POAG的发生发展，而且影响眼压的升降。鉴于体外培养与体内环境的异同，本研究采用ELISA法测定了POAG患者与正常对照组患者房水中Gremlin的含量，结果显示前者Gremlin含量较后者增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。本次免疫组化结果显示POAG患者小梁网细胞中Gremlin表达较正常对照组明显增高，与Robert实验结果一致。

表1 实验组（20例）与对照组（18例）房水中Gremlin含量（ng/ml）

注：正常组小梁结构完整，小梁网眼疏松，小梁细胞贴附于小梁柱上，细胞胞浆中未见阳性染色（×40）；图1 正常对照组免疫组织化学染色像；注：小梁内皮细胞脱落、变性，部分小梁网眼变窄，甚至闭塞，小梁细胞胞浆中见棕黄色阳性染色（×40）图2 POAG患者小梁网免疫组织化学染色像

Gremlin究竟通过何种机制参与POAG发展？目前国内尚无关于Gremlin在眼部疾病中的研究。2007年Henala［7］等研究发现Gremlin具有促使上皮向间充质转化的功能。Gremlin是α-肌动蛋白的上调因子，能促进小梁网细胞微丝肌动蛋白的表达。但是Gremlin的过度表达势必引起肌动蛋白的过度表达，使小梁网挛缩，失去弹性，正常结构塌陷，从而不利于房水引流。

综上所述，Gremlin在POAG的发生、发展中起着重要作用。对于Gremlin的研究也为临床上POAG的检测和治疗提供了新思路，如房水中Gremlin含量的检测能否作为POAG的筛查指标，抑制Gremlin的表达能否延缓POAG的发展。当然，本研究仅从ELISA和免疫组化的方法研究了房水和小梁网细胞中Gremlin的表达，需要进一步从动物实验和细胞实验证实Gremlin的作用。

［1］陈林，闻毅颐. 小梁网细胞外基质与原发性开角型青光眼的病因研究［J］. 中国实用眼科杂志，1998，16（2）：71-73.

［2］鲁一兵，刘超. Gremlin研究进展［J］. 国际内科学杂志，2007，34（3）：166-169.

［3］裴澄，马波，康前雁，等. Gremlin对人晶状体上皮细胞转分化和细胞外基质合成的影响［J］. 中华眼科杂志，2015，51（8）：597-603.

［4］Wordinger RJ，Fleenor DL，Hellberg PE，et al. Effects of TGF-beta2, BMP-4, and gremlin in the trabecular meshwork: implications for glaucoma［J］. Investigative Opthalmology & Visual Science，2007，48（3）：1191-1200.

［5］程君. 探讨原发性青光眼的临床治疗［J］. 中国继续医学教育，2015，7（5）：64.

［6］高贤荣，刘宽芝. BMP-7和gremlin与糖尿病肾病［J］. 国际泌尿系统杂志，2004，24（3）：385-387.

［7］Lee H，O'Meara SJ，O'Brien C，et al. The role of gremlin, a BMP antagonist, and epithelial-to-mesenchymal transition in proliferative vitreoretinopathy［J］. Invest Ophthalmol Vis Sci.，2007，48（9）：4291-4299.

The Expression of Gremlin in the Aqueous Humor and Trabecular Meshwork of Patients With Primary Open–angle Glaucoma

WANG Jing ZHANG Guangbin Cataract Department，Xiamen Ophthalmic Center Affiliated to Xiamen University，Xiamen Fujian 361001，China

ObjectiveTo identify expression of Gremlin in aqueous humor（AH）and trabecular meshwork（TM）of normal control and patients with primary open-angle glaucoma（POAG）.MethodsAH were 20 cases of patients with POAG. TM specimens were taken from 5 normal persons and 18 cases of patients with simple senile cataract were selected as control group. The expression of Gremlin was studied with ELISA and immunohistochemistry.ResultsGremlin in AH with POAG were significantly higher than the control（P＜0.05）. The trabecular meshwork cells in all patients expressed Gremlin，while the results of the control group were negative.ConclusionGremlin were highly expressed in the AH and TM of the patients with POAG. It suggests that Gremlin played an important role on POAG.

Primary open-angle glaucoma，Gremlin，Aqueous humor，Trabecular meshwork，ELISA，Immunohistochemistry

R341

A

1674-9316（2016）24-0172-03

10.3969/j.issn.1674-9316.2016.24.101

厦门大学附属厦门眼科中心白内障科，福建 厦门 361001 通讯作者：王晶，E-mail：916092710@qq.com