辣椒EST-SSR 标记的开发与验证

李永平，林 珲，康建坂,温庆放*

(1.福建省农业科学院蔬菜研究中心，福建 福州 350013；2.福建省农业科学院作物研究所，福建 福州 350013)

辣椒EST-SSR 标记的开发与验证

李永平1，2，林 珲1，2，康建坂1，2,温庆放1，2*

(1.福建省农业科学院蔬菜研究中心，福建 福州 350013；2.福建省农业科学院作物研究所，福建 福州 350013)

从NCBI 数据库下载118 900条辣椒相关EST，对其进行SSR位点搜索，共搜索出3 343条SSR，分布密度为1/17.20 kb，共有287种重复基元。在辣椒EST-SSR中，二核苷酸(1 476个SSR)和六核苷酸(1 128个SSR)占主导地位，所占比例分别为44.15%和33.74%；出现最多的重复基元是GA/TC，占总数的14.30%，其次为CT/AG(94 个，占8.11%)。针对3 343条含有SSR的EST 设计合成了200对引物。用17份辣椒种质对200对引物进行筛选，196对引物有扩增产物，71对引物表现出多态性，共有220个多态性位点。利用71对多态性引物，对特定亲本P181-2-6和P230-2-5及其杂种一代F1的亲缘关系进行检测，结果说明从辣椒相关EST数据库中开发的SSR引物有较好的可用性。

辣椒；EST-SSR；标记开发；指纹图谱

简单重复序列(Simple sequence repeat，SSR)标记技术因多态性高、灵敏度高、重复性好、数量丰富、分析简便、共显性和特异性等特点[1]，自1989年建立以来，已被广泛用于遗传图谱绘制[2]、重要农艺性状的基因定位[3-4]、生物遗传多样性[5]、品种鉴定[6]等诸多方面。

近年来，测序技术的发展突飞猛进，各种植物的基因组和转录组测序数据迅速增加。EST-SSR 因来自基因的转录区与功能基因有紧密的连锁，且在物种间有较高的通用性，其开发与应用已在小麦[7]、棉花[8]、大豆[9]、花生[10]等大田作物中均有报道，EST-SSR标记在一些主要蔬菜作物中也有一定的开发与应用，如番茄[11]、黄瓜[12]、油菜[13]、大白菜[14]、甘蓝[15]和萝卜[16]。辣椒的EST-SSR标记也有研究，但已公开报道可利用的SSR标记仅有500多个[17-23]，开发标记数量明显偏少，远不能满足辣椒分子育种研究的需要。本研究利用NCBI公共数据库公开报道的近12万条辣椒相关EST，开发EST-SSR 标记并分析其多态性，为辣椒的种质资源分析、指纹图谱、遗传作图和分子标记辅助育种等提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料和模板DNA 的提取

以17份辣椒种质、早熟牛角椒P181-2-6和抗TY的P230-2-5两份辣椒自交系及其杂交后代F1(表1)为引物筛选材料，检测引物的扩增与多态性。所有试验材料均由福建省农业科学院蔬菜中心所提供，于2015年春季种植于本所试验田，在定植缓苗后苗期取幼嫩叶片，采用改良CTAB法提取DNA。

1.2 辣椒EST 来源、EST-SSR 的发掘及分析

辣椒相关EST 来自NCBI(美国国家生物技术信息中心)数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST)，共计118 900条(截至2015年8月)。利用SSRHumter分析软件对下载的EST序列进行SSR搜索。SSR筛选标准为：二、三、四、五和六核苷酸的最少重复次数分别为9、7、5、4、3次以上，所有重复类型的总核苷酸数不能少于18个。

EST-SSR的出现频率(%)=(检出的SSR个数/EST 总数)×100%；EST-SSR平均分布距离 = EST 总长度/SSR个数。优势基元中SSR出现频率(%)=(优势重复基元SSR数量/优势重复基元SSR总数量)×100%。

1.3 EST-SSR的引物设计与合成

利用primer premier 5.0软件对含有SSR的EST设计引物，并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物设计的主要参数：引物长度控制在15～30 bp，预期产物长度控制在150～350 bp；引物3′端不出现3个以上的连续碱基，引物的3′端避免使用碱基A；引物序列的GC含量选择在40%～60%；Tm值50～60℃；引物分值90以上。选择以不同主导重复基元类型设计的EST-SSR引物200对，由福州博尚生物技术有限合成。

1.4 引物有效性检测

利用17 份辣椒种质、早熟牛角椒P181-2-6和抗TY的P230-2-5两份辣椒自交系及其杂交后代F1 对设计的引物进行检验。PCR反应体系为20 μL，50 ng模板DNA，0.3 μmol·L-1引物，0.5 mmol·L-1dNTP，1.0 UTaqDNA聚合酶，2.0 mmol·L-1MgCl2，2.0 μL10×PCR缓冲液，加入灭菌的超纯水至20 μL。所用试剂均购自上海生工生物工程有限公司。PCR 扩增反应条件是：94℃ 预变性5 min；94℃ 变性45 s，50℃退火45 s，72℃ 延伸1 min，40 个循环；72℃延伸10 min。PCR扩增产物用20 g·L-1的琼脂糖凝胶电泳检测，90 V稳压电泳1 h，EB染色，在UVP公司的GDS8000凝胶成像系统上观察并拍照。为保证数据准确、可靠，每块胶板均由2人独立记录，然后比对，有争议的数据作缺失处理。

表1 17 份辣椒种质及特定亲本和后代Table 1 Seventeen typical C. annuum germplasms and specific parents and F1 hybrids

1.5 种质亲缘关系分析

基于17份辣椒种质DNA 扩增产物的电泳图谱，有带扩增记为1，无带记为0，利用NTSYSpc2.0对统计结果进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 辣椒EST-SSR信息分析

2.1.1 辣椒EST的基本信息及EST-SSR 频率和密度 从NCBI下载118 900 条辣椒EST，经搜索共挖掘到3 343 个SSR，发生频率2.82%，平均分布距离为17.2 kb。结果(表2)表明，辣椒具有丰富的EST-SSR 类型，二、三、四、五、六核苷酸重复类型都有出现，但不同核苷酸重复类型出现的频率相差较多。核苷酸重复类型以二核苷酸重复与六核苷酸重复为主，二者占总SSR 比例的77.89%，其中二核苷酸重复中的SSR 数量最多，占总SSR比例的44.15%，其次是六核苷酸重复重复较多，比例为33.74%。

搜索共观察到287种重复基元，六核苷酸重复中出现最多的重复基元达182 种，占基元种数的63.41%。二核苷酸10 种，三核苷酸36 种，四核苷酸22 种，五核苷酸37 种。

辣椒EST中平均每17.2 kb 出现一个SSR，不同重复类型的SSR覆盖的平均距离差异较大，SSR数越多其覆盖的平均距离越小(表2)。

表2 辣椒 EST 中SSR 出现频率Table 2 Occurrence of SSRs in ESTs of C. annuum

2.1.2 辣椒EST-SSR 重复基元类型和比例 各种不同重复基元中出现最多的是二核苷酸重复类型GA/TC，占总SSR 的比例为18.37%，其次是AG/CT，比例为12.83%。二核苷酸中，以GA/TC重复基元占优，占41.60%，GA/TC、AG/CT、AT/TA三者占93.03%，但CG/GC 重复基元没有出现；三核苷酸中，各重复基元分布较为均衡；四核苷酸中，以TAAT/ATTA重复基元为主，占36.08%；五核苷酸中，重复基元主要为ATATA/TATAT，比例为49.69%；六核苷酸中，以TCATGG/CCATGA重复基元类型为主，占比例10.28%。

2.1.3 辣椒EST-SSR重复基元长度 辣椒辣椒EST-SSR二至六核苷酸平均基元长度变化范围差异很大，二核苷酸的长度变化范围最大，为18～152 bp，五核苷酸长度范围最小为20～30 bp；从平均长度看，二核苷酸最长达43.82 bp，其次是三核苷酸25.09 bp、四核苷酸21.86 bp、五核苷酸的20.57 bp、六核苷酸18.10 bp(表4)。

2.2 辣椒EST-SSRs 引物有效性验证

2.2.1 EST-SSRs 标记在17份辣椒种质中的多态性 选择了不同重复类型和重复次数的EST-SSRs 设计合成了一批引物。其中具二苷酸重复的引物50 对，三核苷酸重复引物49对，四核苷酸重复引物10 对，五核苷酸重复引物11 对，六核苷酸重复引物80对并以17 份辣椒种质的基因组DNA为模板对合成的200 对引物进行有效性检验，能清晰扩增产物的引物有196 对，扩增有效率为98.00%；其中71 对EST-SSR引物具有多态性，共扩增出220 个多态性位点，平均每个引物产生3.1 个多态性位点。由表5可以初步看出，不同核苷酸重复引物的扩增有效率和多态性比例不同，以二核苷酸重复开发出的引物，多态性比例最高，为46.00%，而基于五核苷酸重复开发的引物多态性比例最低为9.10%。在基元重复数量最多(表3)的二核苷酸、六核苷酸开发引物的效率较高。

表3 辣椒EST-SSR优势基元重复类型Table 3 Predominant types of SSR motifs in ESTs of C.annuum

表4 辣椒EST-SSR 基元重复长度Table 4 Predominant types of SSR motifs in ESTs of C.annuum

表5 不同核苷酸重复引物的扩增有效率和多态性比例Table 5 Proportions of effective and polymorphic primers for different types of motifs

在17份辣椒种质扩增中不同引物扩增出的多态性位点数量不同。部分引物对17份辣椒种质基因组DNA的扩增，显示较丰富多态性(图1、2)。

2.2.2 EST-SSRs标记在特定材料中的共显性 用具有多态性的71 对引物，对亲本P181-2-6 和P230-2-5 及其杂种一代F1 的基因组DNA进行扩增，在这一特定亲本间仍具有多态性的引物43 对，其中在亲本及其F1 中呈共显性的标记共有27 对(图3-A)，显偏母型的有9 对(图3-B)，偏父型的有7 对(图3-C)。从多态性和显性、共显性来看，基于EST序列开发辣椒SSR引物是可行和有效的，这些标记可用于辣椒遗传多样性分析、指纹图谱、遗传图谱构建、基因定位以及分子标记辅助育种等方面。

2.3 EST-SSR 标记在辣椒种质遗传关系分析中的应用

以71 对多态性引物对17 份辣椒种质进行聚类分类(图4)，在相似系数0.64 处可将其分为5大类。PA001、PA002、PA003、PA004聚为一类，均为黄椒类型，PA006、PA010、PA014、PA013、 PA015、PA011、PA016、PA017、PA012均为牛角椒类型，PA009为羊角椒，PA005、PA008为朝天椒，PA007为野生椒。结果表明开发的EST-SSR标记能很好地将辣椒亲缘关系鉴别出来。

3 讨 论

本研究基于从NCBI数据库下载的118 900条辣椒EST，进行SSR位点搜索，共得到3 343 条SSR，发生频率2.82%，分布密度为1/17.20 kb，包括287 种重复基元。在辣椒EST-SSR中，二核苷酸(1 476 个SSR)和六核苷酸(1 128 个SSR)占主导地位，所占比例分别为44.15%和33.74%；出现最多的重复基元是GA/TC，占总数的 14.30%，其次为CT/AG(94 个，占8.11%)。支莉等[23]2010年从NCBI数据库获得116 952条辣椒ESTs序列，发现1 736个微卫星，EST-SSRs序列出现频率为1.92%。在辣椒EST-SSRs中，二核苷酸重复类型出现频率最高，占总SSR的56.4%，其次是三核苷酸重复类型，占总SSR的23.3%。共检测到149种基序重复类型，重复基序出现频率最高的为GA/TC，AG/CT次之。吴智明等[24]2012年通过对数据库中32 295 条非冗余的辣椒EST序列进行搜索，发现3 396 个SSR位点，EST-SSR频率为10.52%，平均分布距离为4.46 kb。在辣椒EST-SSR中，二核苷酸和三核苷酸重复基元占主导地位，分别占总SSR的43.02% 和37.84%。优势重复基元为GA/TC、AG/CT和AT，分别占15.99%、11.98%和l1.37%。不同研究者研究的结果不尽相同，可能搜索软件、搜索的核苷酸重复类型的长度标准设定不同有关。现行的SSR搜索标准中有12、15、18 bp 3 种重复基元总长度。不同的研究者采用不同的搜索标准，导致结果不同。根据Schlötterer等[25]的研究，SSR的变异频率与基元重复数呈正相关，即重复基元的重复次数越多则SSR的多态性潜能越大。在本研究中采用了18 bp的标准进行SSR位点的筛选。目前EST-SSR位点搜索软件如SSRIT、SSRhunt、MIAS、SSRfinder等，本研究用SSRhunt软件，能准确得到EST序列中总SSR位点和重复基元的数量，重复次数及位点位置，为进一步了解辣椒EST-SSR位点信息和以后的引物设计提供了方便。

本研究中六核苷酸重复1 128 个SSR，占33.74%，以 TCATGG/CCATGA、ACGAGA/TGCTCT和CTGCTC/GAGCAG 3种重复基元为主，占六核苷酸重复基元总比例的24.03%。与前人的研究结果不同。在大多作物中，六核苷酸重复基元类型均不常见，仅在甘薯[26]、玉米[27]和萝卜[16]中见到报道，这些可能与物种本身的基因组或转录组序列差异性有关。从设计合成了引物的多态性来看，基于六核苷酸重复基元设计的引物多态性达 33.75%，有较高的开发价值。

虽然一般认为，由于基因编码序列的保守性等原因导致 EST-SSR 揭示种间多态性低于源于基因组的 SSR 标记。但是，17 份辣椒种质对开发引物鉴定结果，多态性达35.5%，在特定组合中的共显性标记比例为62.79%。本研究基于辣椒EST-SSR信息分析和标记开发是有效可行的，可用于辣椒遗传多样性分析、指纹图谱、遗传图谱构建等。

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(责任编辑：柯文辉)

Development and Utility of EST-SSR Marker inCapsicumannuumL.

LI Yong-ping1,2，LIN Hui1，2，KANG Jian-ban1,2，WEN Qing-fang1,2*

(1.VegetableResearchCenter，FujianAcademyofAgriculturalSciences，Fuzhou，Fujian350013，China；2.CropsResearchInstitute，FujianAcademyofAgriculturalSciences，Fuzhou，Fujian350013，China)

A total of 118,900 ESTs inCapsicumannuumL were downloaded from NCBI for identifying and developing an SSR marker. As a result, 3,343 SSRs in the ESTs with an average of one SSR per 17.20 kb were found, including 283 SSR motifs. Analysis on the SSR motifs revealed that they were mostly di-nucleotides (1,476 SSR) and hexa-nucleotides (1,128 SSR), accounting for 44.15% and 33.74% of the total, respectively. GA/TC was the most frequently found motifs (14.30% of all), which was followed by CT/AG (94 SSR, and 8.11% of all). From the 3,343 SSR-containing ESTs, 200 primer pairs were designed and validated for amplification using 17 pepper inbred lines. The results showed that 71 primer pairs yielded 220 amplification bands. Using those 71 pairs of polymorphic primers, the genetic relationship between the parents, P181-2-6 and P230-2-5, and their F1 hybrid was determined. It appeared that the SSR markers identified from the ESTs ofC.annuumwere potentially of practical applicatios.

CapsicumannuumL.; EST-SSR; marker development; fingerprinting

2016-07-11初稿；2016-09-23修改稿

李永平(1974-)，女，副研究员，研究方向：蔬菜分子育种(E-mail：248937256@qq.com) *通讯作者：温庆放(1965-)，男，研究员，研究方向：蔬菜育种(E-mail：fjvrc@163.com)

福建省自然科学基金项目(2014J01115)；福建省科技计划重大专项(2013NZ0002-3)

S 641.3

：A

：1008-0384(2016)11-1187-06

李永平，林珲，康建坂，等.辣椒EST-SSR 标记的开发与验证[J].福建农业学报，2016，31(11)：1187-1192.

LI Y-P，LIN H，KANG J-B，et al.Development and Utility of EST-SSR Marker inCapsicumannuumL.[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(11)：1187-1192.