暗孢节菱孢菌引起面部感染1例及相关研究

陈雪雯 朱红梅 温海

(上海市长征医院皮肤科 全军真菌病重点实验室 上海市医学真菌分子生物学重点实验室，上海 200003)

·论著·

暗孢节菱孢菌引起面部感染1例及相关研究

陈雪雯 朱红梅 温海

(上海市长征医院皮肤科 全军真菌病重点实验室 上海市医学真菌分子生物学重点实验室，上海 200003)

目的 报道暗孢节菱孢菌 (Arthriniumphaeospermum)引起的面部皮肤感染1例并进行相关真菌学研究。方法 患者女，29岁，两颊对称性浸润性红斑数年。皮损直接镜检、真菌培养，经形态观察、分生鉴定菌种、并进行体外药敏试验及利用豚鼠致病性实验重现组织病理特征。结果 直接镜检未见明显菌丝，体外培养后为单一菌落，经棉兰染色、小培养、扫描电镜、分子生物学均鉴定为暗孢节菱孢菌 (Arthriniumphaeospermum)，均可见典型特征。体外药敏试验提示，该菌对卡泊芬净、米卡芬净、泊沙康唑、雷夫康唑、伏立康唑、特比萘芬敏感，对伊曲康唑、氟康唑耐药。豚鼠致病性实验中，对照组和免疫抑制组豚鼠皮下注射处大体可见脓肿，体表涂抹处大体表现红斑、丘疹、脱屑，免疫抑制组症状持续较久。皮下注射处较体表涂抹处有明显的组织病理学改变，可见多核巨细胞包裹菌丝或孢子，伴组织细胞、中性粒细胞、淋巴细胞浸润。结论 该患者为罕见的暗孢节菱孢菌 (Arthriniumphaeospermum)引起的皮肤真菌感染。免疫功能对该菌感染所致疾病的临床过程可能有影响。

暗孢节菱孢；皮肤真菌病；动物替代试验

[Chin J Mycol，2016，11(6):357-360]

暗孢节菱孢菌 (Arthriniumphaeospermum)是一种世界性分布的真菌，宿主涉及毛竹、苔草、芦苇等56种植物，也可存在于空气、动物 (包括人)、土壤和植物碎屑、秸秆、青贮饲料和木材，营腐生生活，是一种植物致病菌[1]，迄今鲜见人类致病的报道。1989年Rai MK[2]首次从1例红斑结节患者皮肤分离出变种Arthriniumphaeospermumvar.indicum。在国内，1990年、2005年分别由赵玉明等[3]、吕桂霞等[4]报道该菌引起头皮感染、臀部感染各1例。我们近日诊治1例面部感染患者，研究报道如下。

1 材料和方法

1.1 病历资料

患者女，29岁，病史10 a。初发时表现为左面部反复红斑，钱币大小，上附有黄色结痂。病情反复，生理期前加重，5 a后发展至右侧面部，其后病情反复，期间曾外院间断口服伊曲康唑、特比萘芬、雷公藤、烟酰胺、西替利嗪，外用0.1%他克莫司软膏、丁氢化可的松软膏，自血疗法、激素针等治疗。目前皮损由钱币大小发展至双侧面颊大面积边界清楚的红斑伴结痂、隆起、瘙痒来我院就诊。

专科查体：双侧面部可见对称浸润性红斑 (见图1a～b)。红斑边界清楚、高出皮面、油腻感，表面呈黄色多角形结痂，触之略硬，皮温升高，无明显压痛感。查血常规、肝肾功能、免疫指标未见异常。

1.2 标本采集

皮损边缘及痂皮取材，用10%KOH制片行直接镜检。

1.3 真菌培养方法

将皮损规范操作,取适量皮屑并接种到沙氏培养基。另将菌株接种于沙氏培养管，培养2周后将菌落转种到SDA、PDA、OA培养基上，分别置于28℃、30℃、35℃、37℃培养箱培养，连续观察菌落变化。

1.4 观察菌丝

于载玻片上滴加1滴乳酸石炭酸棉兰染色液，从菌落中挑取适量菌丝放入载玻片上的液滴中，将菌丝分散开，盖上盖玻片，置于显微镜下观察。

1.5 小培养观察

将该菌用小培养的方法用OA在玻片上直接培养，30 d产孢后在扫描显微镜下观察。

1.6 分子鉴定

菌株培养7 d后，用艾德莱试剂盒提取真菌DNA，PCR法扩增真菌核糖体RNA基因转录间隔2区域，真菌通用引物：ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')，ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，由生工生物技术有限公司合成。PCR反应体系：总体积50 μL，含EasyTap MIX 25 μL (北京全式金生物技术有限公司)，ITS4 (10 uM)2 μL，ITS5 (10 uM)2 μL，模板1.5 μL，ddH2O 19.5 μL。PCR反应条件：95℃ 3 min，95℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 1 min共33个循环，最后72℃延伸5 min，之后12℃保持。取5 μL PCR产物于2%琼脂糖凝胶在120 V电压下电泳30 min，用溴化乙锭染色，凝胶成像系统下观察。PCR产物的双向序列测定委托美吉生物公司协助完成。

1.7 真菌药敏试验

将在OA上28℃培养30 d的产孢菌落用吐温生理盐水取适量孢子，用含MOPS的1640培养液稀释，根据M38-A2[5]，将其稀释成0.6×104CFU/mL菌液，加入100 μL/孔到包被好12种一定浓度梯度[6]的抗真菌药物的单克隆培养板中。将Candidaparapsilosis(ATCC 22019)作为标准菌株。因样本菌株在28℃生长最好，且在35℃不生长，故将其置于28℃培养，48 h后观察，Candidaparapsilosis置于35℃ 48 h后观察，得出MIC值。

1.8 动物实验

选健康豚鼠18只，450～500 g，雌雄不限，均分为2组，A组为对照组，不做预处理；B组为处理组，实验前4 d和前2 d用倍他米松注射液7 mg·kg-1·d-1股部肌肉注射；且接种后，给予地塞米松注射液7.5 mg/kg腹腔注射，隔日1次，共4次。实验开始当天，背部备皮，做好自体处理区域划分。常规消毒后，右侧用无菌胶布黏贴撕去，重复4次至肉眼可见点状出血为宜，涂布菌悬液，空白对照组涂以生理盐水；左侧4处实验区，间隔皮下注射真菌孢子、无菌生理盐水。

将培养的菌株用0.9%的无菌生理盐水配制成菌悬液，皮下注射、表皮涂布2种方法每处接种108/mL菌悬液100 μL于豚鼠[7]背部上皮。每天观察皮损状况，包括：红斑、脱屑、结痂、毛发生长情况。于感染后第12天，第21天处死动物，取材，组织切片 (HE染色、PAS染色)。

2 结 果

2.1 直接镜检

2次皮损边缘及痂皮直接镜检，用10%KOH制片均未见明显菌丝。

2.2 真菌培养

将皮损规范操作,取适量皮屑并接种到沙氏培养基,1周可见菌落 (见图2a)。将其转种于SDA、PDA、OA分别置于28℃、30℃、35℃、37℃培养，7 d后，该菌在三种培养基生长情况见下表 (见表1)。1 d萌发，初为丝状白色菌落，1周左右可见橙黄色色素产生 (图2b～c为PDA培养1周结果，图3a～b为不同温度下该菌株在SDA培养1周结果)。

表1 该暗孢节菱孢菌在不同培养基不同温度下的生长情况记录

Tab.1 The growth of obtained stain on different medium at different temperature

OAPDASDA萌发1d1d2d产孢30d48d60d28℃6.1cm4.1cm7.2cm30℃5.7cm3.8cm6.9cm35℃未生长未生长未生长37℃未生长未生长未生长

2.3 显微镜

棉兰染色镜下可见透明管状分隔菌丝 (见图4a～b)，90°侧支。分生孢子从葫芦形母细胞上单个产生，垂直于菌丝生长。棉兰染色及小培养均可见暗棕色椭圆形晶状体样孢子，中间可见赤道痕，可见出芽时从该处向两端凸起，为该菌鉴别特征 (见图4c～d)。

2.4 扫描显微镜

可见垂直分支的分隔菌丝及特征性孢子：分生孢子呈双凸透镜样，(8～12)×(5～7) μm，可见赤道部位发芽裂隙，为该菌鉴别特征 (见图5a～c)。

2.5 分子测序及鉴定

ITS区测序结果提示：Arthriniumphaeospermum(详见http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi#alnHdr_162285923：blastn suite：RID-F6SBB06R01R；Query ID：lcl|Query_128499)。

2.6 体外药敏试验

48 h后观察，得出MIC值，分别为卡泊芬净0.5 μg/mL，米卡芬净0.25 μg/mL，泊沙康唑0.5 μg/mL，雷夫康唑0.031 25 μg/mL，伏立康唑0.25 μg/mL，特比萘芬2 μg/mL，伊曲康唑>64 μg/mL，氟康唑>64 μg/mL。

2.7 动物实验

处理组和对照组均可见皮损。表皮涂菌处：免疫抑制组以脱屑为主，对照组以红斑丘疹为主 (见图6a～b)。皮下注射处 (见图6c～f)：均表现为浸润性红斑、脱毛、小结节、灰白色皮下脓肿，处理组较对照组皮损持续时间久、脓肿较大、触之浸润更明显。病理结果提示两组都有病理性浸润，PAS染色可见紫红色分隔菌丝，椭球形棕褐色孢子，可见大量组织细胞、多核巨细胞、中性粒细胞和淋巴细胞浸润。

2.8 治疗

该患者对伊曲康唑口服200 mg/次，2次/d，7 d/月，5个月后效果见图7a～b。此后随访9个月，多次真菌镜检和真菌培养，未见阳性结果。

3 讨 论

暗孢节菱孢菌 (Arthriniumphaeospermum)是一种植物寄生菌，目前植物致病报道多见，而人种致病报道仅4例[1-4]。

该患者5次皮损镜检都未见菌丝，笔者认为与以下因素有关：①患者病史时间长，可能皮肤屏障结构改变有关，如表皮萎缩。②患者一直间断服用特比萘芬或者伊曲康唑，也曾用雷公藤，外用激素软膏，导致表皮真菌难以查出。③有文献报道[3]其破坏毛囊皮脂腺，该暗孢节菱孢菌可能亲脂，入侵后在皮肤较深层，考虑体表为反应性表现可能，最好结合病理学依据，而该患者皮损部位为面部，拒绝行病理活检。

体外药敏试验显示伊曲康唑耐药，而临床上，该患者对伊曲康唑口服200 mg/次，2次/d，7 d/月，5个月后治疗有明显效果。考虑药物在体内外不同内环境下起作用敏感性不用。国内吕桂霞等[4]报道1例暗孢节菱孢菌感染，其也对伊曲康唑耐药。1965年Ellis MB[8]的药敏试验结果是AMB 0.13 μg/mL、5-FC 256 μg/mL、FLZ 128 μg/mL、ITZ 0.5 μg/mL、KTZ 2 μg/mL、MCZ 2 μg/mL，与本研究结果不同。考虑年限较远，药物更新，菌株与人种进化过程中各种因素所致药物敏感性发生变化。

该菌在三种培养基中28℃生长状态最好，在OA生长速度最快，在PDA产色素最早。35℃、37℃培养1周后菌落几乎不生长，不产色素。与国内赵玉明等[3]的37℃生长对照的结果不一致，与国外Rai MK[2]结果一致。由此可推测该菌可能不引起深部感染。

我们进行了动物实验模拟体表感染模型，处理组和对照组均能被该菌感染，且免疫抑制组感染持续时间较对照组久，皮损更明显。结合该患者在皮损严重时常有骨痛主诉，且在抗真菌治疗皮损改善时缓解，考虑免疫状况与该菌入侵并导致感染可能相关，具体机制还需进一步探究。

图1 a～b.患者初次就诊临床照片 图2 a.将皮损接种于SDA 28℃培养7 d，可见两管为同一种菌；b～c.将菌株接种于PDA 28℃培养7 d，可见白色絮状菌丝和橙黄色色素 图3 a～b.28℃、30℃、35℃、37℃下，该菌株在SDA培养1周结果：28℃、30℃生长良好，并能产橙色色素；而在35℃、37℃不生长 图4 a～b.棉兰染色后，可见透明管状分隔菌丝由烧瓶状母细胞垂直长出 (100×);c～d.可见暗棕色晶状体样孢子，簇状分布，中央可见色泽较浅的赤道裂稍突出表面 (100×、40×) 图5 a～c.簇状分布的孢子,呈双凸晶状体形，可见孢子中央赤道痕均匀凸起于孢子一周;菌丝分隔，且垂直于主干分支 图6 a～b.分别为对照组和处理组豚鼠感染后第12天皮损照片;c～f.分别为实验的皮下注射组第21天大体图、化脓处棉兰染色直接镜检图、病理切片HE、PAS染色40× 图7 a～b.伊曲康唑口服200 mg/次，2次/d，7 d/月，5个月后皮损明显好转

Fig.1 a-b.Clinical manifestation during the patient's initial clinic visit Fig.2 a.The write flocculent colony on SDA for 2 weeks at 28℃;b-c.The write flocculent colony and orange pigment on PDA after 7 days at 28℃ Fig.3 a-c.The stain grew on SDA after 7 days respectively at 28℃,30℃,35℃,37℃,it grew well with chromogenesis at 28℃,30℃,and almost didn't grow at 35℃,37℃ Fig.4 a-b.Conidiophores arised singly from a lageniform cell,with hyaline septa;c-d.With cluster distribution,lenticular dark brown conidia provided with an equatorial germ slit,according to microculture and Medan staining Fig.5 a-c.With cluster distribution,lenticular conidia provided with an equatorial germ slit around,hypha with septa and vertical growing form median stem Fig.6 a-b.These areguinea pigs skin lesion photos respectivelyfrom control group and the experimental group 12 days after infected;c-f.Clinical manifestation,direct microscopy of suppurated lesions,and pathologic results of HE,PAS (40×) from the same lesion of the experimental group Fig.7 a-b.After 5-month treatment of oral itraconazole 200 mg/done week a month,lesions were obviously impoved

目前，文献检索国内外对于暗孢节菱孢菌的报道仅4例，且人群致病的研究甚少，流行病学资料不全，对于该菌的毒力、致病力等危害了解不多。就目前报道的案例表明，该菌主要引起浅表感染，表现不一。结合本例，目前常用的抗真菌药物治疗作用明显，但易反复，考虑与患者前期多次间断使用各种药物包括抗真菌药物有关，也与机体免疫状态、药物剂量、使用方法等有关[9]，也不排除目前国内抗真菌药物的人群暴露较广，出现耐药情况。临床医生应对一些少见菌株致病提高警惕，积极深入研究、治疗、随访。

[1] Kirk PM.Arthrinium phaeospermum[J].IMI Descriptions of Fungi and Bacteria，1991，1053:1-2.

[2] Rai MK.Mycosis in man due toArthriniumphaeospermumvar.indicum.First case report[J].Mycoses ，1989，32(9):472-475.

[3] 赵玉明，邓成儒，陈曦，等.我国首次发现暗孢节菱孢菌所致皮肤真菌病：一株新的条件致病性真菌[J].真菌学报，1990，9(3)：232-235.

[4] 吕桂霞，沈永年，陈伟，等.暗孢节菱孢引起皮肤感染一例[J].中华皮肤科杂志，2005,38(4):232-234.

[5] Clinical and Laboratory Standards Institute.Referencemethodforbroth dilution antifungal susceptibility testing of filamentous fungi,2nded.Approved standard.CLSI documentM38-A2[S].Clinical and Laboratory Standards Institute,Wayne,PA,2008.

[6] Deng S,de Hoog GS,BadaliH,et al.Invitroantifungal susceptibility ofCladophialophoracarrionii,an agent of human chromoblastomycosis[J].Antimicrob Agents Chemother.2013 ，57(4):1974-1977.

[7] Shimamura T1,Kubota N,Shibuya K.Animal Model of Dematophytosis[J].J Biomed Biotechnol,2011,2012(1):180-197.

[8] Ellis MB.Dematiaceous hyphomycetes[M].6th ed.Oxfordshire ，CABI Publishing，1965:1-46.

[9] 廖万清，顾菊林.真菌耐药的现状与对策[J].药学服务与研究,2006,6(3):161-164.

[本文编辑] 王 飞

·短篇论著·

A case of cutaneous mycosis caused byArthriniumphaeospermum

CHEN Xue-wen,ZHU Hong-mei,WEN Hai

(PLAKeyLaboratoryofFungalDiseasesandShanghaiKeyLaboratoryofMolecularMedicalMycology,DepartmentofDermatology,ChangzhengHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200003,China)

Objective Report of a case of fungal infection caused byArthriniumphaeospermumand the relevant mycological study.Methods A-29-woman had suffered symmertrical infiltrative erythema for several years.Direct microscopy,culture,microculture,strain identification,drug susceptibility testinvitro,animal experiment were performed.Results While direct microscopy was negative,culture was positive andArthriniumphaeospermumwas identified.The typical characteristics of this isolate were observed with Medan staining,microculture and scanning electron microscopy.This isolate was resistant to itraconazole and fluconazole,but was susceptible to caspofungin,micafungin,posaconazole,ravuconazole,voriconazole and terbinafine.Animal experiment shows the veryArthriniumphaeospermumwas able to cause disease.Conclusion This was a rare dermatomycosis caused byArthriniumphaeospermum.Mycological examinations,drug susceptibility testinvitro,and animal experiment would have active guidance meaning and applied value for further cases.Abnormal immune status might be a risk factor for such cases.

Arthriniumphaeospermum；dermatomycoses;animal testing alternatives

国家自然科学基金 (31470252，81271800，31270181)

陈雪雯，女 (汉族)，硕士研究生在读.E-mail:snowflychen@163.com

温海,E-mail:wenhaipfk@126.com;朱红梅,E-mail:hmzhu_cn@163.com

R 756.2

A

1673-3827(2016)11-0357-04

2016-10-01