高效液相色谱-串联质谱内标法测定乳品中左旋肉碱含量

徐敦明，陈　燕，张　缙，余宇成，冯　峰，张　峰，储晓刚

(1.厦门出入境检验检疫局　检验检疫技术中心,福建　厦门　361026；2.中国检验检疫科学研究院

食品安全研究所，北京　100123)



高效液相色谱-串联质谱内标法测定乳品中左旋肉碱含量

徐敦明1*，陈燕1，张缙1，余宇成1，冯峰2，张峰2，储晓刚2

(1.厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心,福建厦门361026；2.中国检验检疫科学研究院

食品安全研究所，北京100123)

摘要：建立了高效液相色谱-串联质谱内标法测定乳品中左旋肉碱含量的方法。样品经0.1 mol/L HCl溶解，采用乙腈溶液沉淀蛋白，以HILIC色谱柱分离待测物，采用鞘流电喷雾离子化，正离子多反应监测模式(MRM)检测，内标法定量。在3个加标水平下，左旋肉碱的平均加标回收率为85.2%~102.0%，相对标准偏差(RSD,n=6)为7.6%~14.3%，方法检出限(LOD)为50 μg/kg，定量下限(LOQ)为200 μg/kg。运用该方法对20个乳品样品中的左旋肉碱含量进行测定，检出含量为68 ~165 mg/kg，与样品标签的符合率达95%。该方法快速、简便、准确，适用于乳品中左旋肉碱含量的测定。

关键词：高效液相色谱-串联质谱；左旋肉碱；乳品；内标

Determination ofL-Carnitine in Dairy Products by High Performance Liquid Chromatography-Electrospray Ionization Tandem Mass SpectrometryXU Dun-ming1*,CHEN Yan1,ZHANG Jin1,YU Yu-cheng1,FENG Feng2,ZHANG Feng2,CHU Xiao-gang2

(1.Technical Center of Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Xiamen361026,China;2.Institute of

Food Safety,Chinese Academy of Inspection and Quarantine,Beijing100123,China)

Abstract：A method of HPLC-MS/MS with internal standard for the determination of L-carnitine in dairy products was developed.After the sample was dissolved in 0.1 mol/L HCl solution and its protein was precipitated with acetonitrile,the object was separated with a HILIC chromatographic column,tested by HPLC-MS/MS with sheath flow electro-spray ionization under positive ion scanning and multiple reaction monitoring(MRM) mode,and quantified by the internal standard method.The average recoveries at three spiked levels were in the range of 85.2%-102.0% with RSDs(n=6) of 7.6%-14.3%.The limit of detection (LOD) was 50 μg/kg and the limit of quantitation(LOQ) was 200 μg/kg.The proposed method was applied in the analysis of several real samples of different origins from overseas,and 20 samples were screened for L-carnitine with content range of 68-165 mg/kg,of which only 1 sample did not match with the label.This method was rapid,simple and accurate,and was suitable for the determining of L-carnitine content in dairy products. [3]Zhong X L,Chen J,Yu Y H.Inorg.Anal.s China(钟新林,陈军,余彦海.中国无机分析化学),2012,2:71-74.

Key words：HPLC-MS/MS；L-carnitine；dairy products；internal standard

左旋肉碱(L-Carnitine)，又称卡尼丁或L-肉碱，存在于大多数哺乳动物组织中，能够促进脂肪酸向线粒体中传输，达到氧化分解脂肪的功效[1]。左旋肉碱不仅在能量产生和脂肪代谢过程中起重要作用，而且在维持婴儿生命及促进婴幼儿发育的某些生理过程，如生酮作用、氮代谢等方面均具有一定的功能。由于婴儿自身合成左旋肉碱的能力较弱，因此必须通过补充外源性左旋肉碱才能满足身体需要[2]。目前，世界上已有22个国家允许在婴儿奶粉中添加左旋肉碱[3]。我国也规定可在婴幼儿奶粉中添加适量的左旋肉碱。国家强制性标准GB 14880-2012中规定左旋肉碱在儿童用调制乳粉中的添加量为50~150 mg/kg，其它用途调制乳粉为300~400 mg/kg[4]。GB 10765-2010[5]及 GB 10767-2010[6]中规定左旋肉碱为可选择性成分，如需添加，添加量最小值为0.3 mg/100 kJ。

目前，国内外已报道的左旋肉碱测定方法主要包括分光光度法[7-9]、免疫法[10-11]、毛细管电泳法[12]、离子色谱法[3,13]、液相色谱法[14-17]以及质谱法[2,18]等。但分光光度法需酶解且检出限高，离子色谱或液相色谱法的特异性差。GB 29989-2013[9]采用分光光度法，干扰大，无法进行确证实验。文献报道的液相色谱-串联质谱法[2]，基质效应显著，影响分析的准确性。为保障消费者权益，加强对奶粉市场的监管，建立快速、简便、可靠、准确的左旋肉碱测定方法十分必要。针对现有方法的缺点，本文建立了特异性强、灵敏度高的高效液相色谱-串联质谱内标法测定奶粉中的左旋肉碱含量。

1实验部分

1.1仪器与试剂

Agilent 6460三重四极杆质谱仪，配Agilent 1290高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，Agilent Jet Stream电喷雾离子源(AJS ESI)；高速离心机(上海安亭科学仪器厂)；涡旋混匀器；Milli-Q超纯水系统。

乙腈、甲醇(色谱纯，德国Merck公司)，甲酸(色谱纯,Fisher公司)，氨水(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，浓盐酸(优级纯，国药集团化学试剂有限公司)。标准物质：左旋肉碱和左旋肉碱(d3)内标物(纯度均大于98%，德国Dr.Ehrensterfer公司)。

称取适量标准品，用乙腈-水(90∶10)溶液配成1 000 mg/L的储备液，储存于0~4 ℃冰箱。根据实验需要，用乙腈-水(90∶10)溶液稀释标准储备液，配成适当浓度的标准工作溶液。

SPE小柱(3 mL,60 mg,Waters公司)：WCX(混合型弱阳离子交换柱)、HLB(亲水亲脂小柱)、MCX(混合型阳离子交换柱)。

1.2样品前处理

1.2.1提取称取1.00 g(精确至0.01 g)乳品样品于250 mL三角瓶中，加入100 μg左旋肉碱(d3)内标液、30 mL 0.1 mol/L的HCl溶液，涡旋振荡1 min，超声提取15 min后，移入100 mL容量瓶中，用10 mL 0.1 mol/L HCl分2次涮洗三角瓶，洗涤液移入容量瓶中，以0.1 mol/L HCl定容至100 mL，取1 mL提取液于20 mL试管中，加入9 mL乙腈溶液，涡旋混匀1 min后取部分于5 mL离心管，16 000 r/min离心5 min，所得上清液待净化。

1.2.2SPE净化强阳离子交换柱分别用3 mL甲醇、3 mL水和3 mL 10 mmol/L 的盐酸水溶液进行活化，移取1 mL上述上清液以1滴/秒的速度过柱，完成后用3 mL 10 mmol/L 的盐酸水溶液淋洗，最后用2 mL 4%氨水甲醇溶液洗脱。洗脱液于40 ℃经氮吹至近干后，用0.1%甲酸水溶液定容至1 mL，过滤膜后，供测定。

表1　左旋肉碱及其内标物的质谱参数

*quantitative ion；CE：collision energy；F：fragmentor voltage

1.2.3LC-MS/MS条件色谱柱：Agilent HILIC(100 mm× 2.1 mm,3.5 μm)。流动相：A为0.1%甲酸水，B为乙腈；洗脱梯度程序：0 ~2.0 min，90%B，2.01 ~6.0 min，90%~45%B，6.01 ~10.0 min，45%~90%B；流速：0.3 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：2 μL。采用AJS ESI源，正离子多反应监测模式(MRM)检测。雾化气压力：310.3 kPa；喷嘴电压：500 V；干燥气：温度300 ℃，流速10 L/min；鞘气：温度325 ℃，流速8 L/min；毛细管电压：3 500 V。左旋肉碱及其内标物的定量和定性离子、碰撞能量和碎裂电压等参数见表1。

2结果与讨论

2.1质谱条件的优化

使用目标化合物标准溶液，优化左旋肉碱及其内标物的质谱条件。在Scan模式下，化合物进入一级质谱后，可产生稳定的[M+H]+离子，并确定为化合物母离子；在SIM模式下，对化合物的碎裂电压进行优化；母离子进入二级质谱，将发生断裂或重排等反应产生不同的离子碎片；在Product ion 模式下，对化合物母离子施加一定的碰撞能量后，得到其相应的离子碎片；最后在MRM模式下，优化目标物离子碎片的最佳碰撞能量。左旋肉碱及其内标物的最佳质谱参数见表1，图1为左旋肉碱及其内标物的总离子流图和MRM色谱图。

2.2色谱条件的优化

通过结构与性质分析，可知左旋肉碱属于极性较强的化合物，因此，在反相色谱柱上很难被保留，若使用C18等反相色谱柱，通常需加入离子对试剂，但该操作繁琐、试剂用量大且易污染仪器。而正相色谱柱对强极性物质有较好的保留。本研究比较了C18色谱柱和HILIC色谱柱对左旋肉碱的保留效果，结果显示，C18色谱柱对目标化合物的保留效果差，约1.4 min出峰，而HILIC柱的保留能力较强，约3.7 min出峰。因此，本实验选用Agilent-HILIC(100 mm × 2.1 mm,3.5 μm)作为分离色谱柱。

目标化合物采用MRM正离子扫描模式，有机相常选用乙腈溶液，水相通常使用甲酸水、乙酸铵溶液或两者混合溶液。通过对比发现，选用0.1%甲酸水溶液作为水相时，目标化合物的灵敏度与分离效果最好,参考保留时间为3.65 min,标准溶液色谱图见图1A。因此，实验选择0.1%甲酸水-乙腈为流动相。

2.3样品前处理优化

左旋肉碱属于极性较强的化合物，因此水可作为其提取溶剂。然而，乳品中含有蛋白质等大量的化合物，若直接用水提取，杂质将一并被提取出，影响左旋肉碱在质谱中的离子化效率，从而影响分析测定的准确性。本文选用0.1 mol/L HCl溶液作为提取溶剂，既可以除去部分杂质，也可以促使左旋肉碱以游离状态溶于溶液中，超声15 min，可使左旋肉碱被充分提取。

实验发现乳品中含有大量的干扰物质，基质效应明显，对分析目标物的抑制作用显著。比较了不同固相萃取柱对样品回收率的影响，结果表明，左旋肉碱在WCX与HLB柱中会随淋洗液流失，目标化合物在淋洗液中有检出。采用MCX柱时，左旋肉碱的回收率大于80%，因此选用MCX柱进行后续实验。将本方法的加标回收率与竺琴等[2]报道的方法进行比较。结果表明，两种前处理方法的测定值差距较大，可达10倍差距。分析其原因，主要是由于基质效应引起。实际样品测定及加标回收实验结果表明，本文前处理方法的测定值更符合标签值或实验添加量。

进一步比较了甲醇-水(1∶1,含75 mmol/L吡啶)和4%氨水甲醇的洗脱效果，结果表明，采用4%氨水甲醇进行洗脱时的回收率较甲醇水洗脱时高。同时比较了乙腈、乙腈-水、0.1%甲酸水、甲醇和4%氨水甲醇作为定容溶剂的影响，结果显示，选用0.1%甲酸水作为定容溶剂时，质谱响应更好，峰形更佳。因此，本方法选用4%氨水甲醇作为洗脱溶剂，0.1%甲酸水作为定容溶剂。

2.4线性范围、检出限与定量下限

在优化条件下，用乙腈-水(90∶10)溶液将标准储备液稀释成浓度分别为0.200，0.500，1.00，5.00，20.0，50.0，100，200 mg/L的系列左旋肉碱及其内标物(0.1 mg/L)标准混合溶液，采用本方法进行HPLC-MS/MS分析。以进样浓度为横坐标(x，mg/L)，定量离子对的峰面积为纵坐标(y)绘制标准曲线。结果表明，左旋肉碱及其内标物在0.200~200 μg/L范围内线性关系良好，左旋肉碱的线性方程为y=2 413x- 1 778，相关系数为0.999 7。通过在不含左旋肉碱的乳品样中添加标准品，按本方法进行测定，以信噪比S/N=3计算检出限(LOD),信噪比S/N=10计算定量下限(LOQ)，得到左旋肉碱的LOD为50 μg/kg，LOQ为200 μg/kg。

2.5准确度与精密度

取3种不同的乳品样品，按照本方法测定左旋肉碱本底含量后，向样品中加入标准品，使样品扣除本底外左旋肉碱的含量分别为40，60，80 mg/kg，平行测定6次，计算加标回收率及相对标准偏差(RSD)，结果见表2。左旋肉碱的平均加标回收率为85.2%~102.0%，RSD为7.6%~14.3%。表明本方法准确度高，重复性好，能够满足乳品样品中左旋肉碱含量的测定要求。

表2　左旋肉碱的平均回收率与精密度(n=6)

2.6实际样品的检测

采用本文建立的方法，对20个实际乳品样品中的左旋肉碱含量进行测定，检出含量为68 ~165 mg/kg，与样品标签的符合率达95%(见表3)。1个实际样品中左旋肉碱的总离子流图见图2。

3结论

本文采用高效液相色谱-串联质谱方法测定了乳品中的左旋肉碱含量。使用0.1 mol/L HCl溶液对样品进行提取，采用乙腈溶液沉淀蛋白，通过MCX小柱对样品进行净化后，以HILIC色谱柱分离，选择0.1%甲酸水-乙腈为流动相洗脱，采用鞘流电喷雾离子化，MRM模式检测，内标法定量。在最佳条件下，左旋肉碱的平均加标回收率为85.2%~102.0%，RSD为7.6%~14.3%，方法的LOD为50 μg/kg，LOQ为200 μg/kg。使用该方法对20个实际乳品样品中的左旋肉碱含量进行测定，检出量为68 ~165 mg/kg，与样品标签的符合率达95%。该方法快速、简便、准确，适用于乳品中左旋肉碱含量的测定。

表3　20种实际样品中左旋肉碱的标签值与测定值

*no matching with the label

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文献标识码:A

文章编号：1004-4957(2016)01-0096-05

doi：10.3969/j.issn.1004-4957.2016.01.016

通讯作者：*徐敦明，博士，研究员，研究方向：食品安全研究与检测,Tel:0592-3269935,E-mail:Xudm@xmciq.gov.cn

基金项目：质检总局公益性行业科研专项项目(2012104002)；行业标准项目(2014B087)

收稿日期：2015-06-04；修回日期：2015-08-05