VEGF-C表达与子宫颈癌前哨淋巴结转移的关系

李　琳　邢　辉　覃小敏　周　敏

作者单位：441021 湖北省襄阳市中心医院

VEGF-C表达与子宫颈癌前哨淋巴结转移的关系

李琳邢辉覃小敏周敏

作者单位：441021 湖北省襄阳市中心医院

【摘要】目的 探讨VEGF-C与子宫颈癌前哨淋巴结转移的关系。方法对82例行宫颈癌根治术治疗的患者进行mRNA和ELISA检测，分析VEGF-C在肿瘤中的表达。结果VEGF-C表达高的多发生淋巴结转移，表达低的患者多数未发生转移，且具有统计学比较意义(P=0.046)。结论在宫颈癌转移患者体中VEGF-C表达与淋巴结转移呈正相关，VEGF-C极有可能成为宫颈癌转移的分子标志物。

【关键词】VEGF-C；子宫颈癌；前哨淋巴结；转移

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:050～052)

据研究表明，现在宫颈癌发病率呈逐年上升的趋势，发病人群也逐渐年轻化，其易转移至其他部位是导致其难治愈的一个重要原因[1-2]。前哨淋巴结作为重要的预后因子参与早期宫颈癌转移，前哨淋巴结的形态学研究在早期宫颈癌已被广泛研究[3-4]。前哨淋巴结的评估被看作为淋巴结转移级数的指标，被用于指导患者手术治疗和放疗化疗，而且还被用作指导切除肿瘤部位[5-6]。

表皮生长因子C(VEGF-C)，是VEGF家族中的一名成员，刺激增殖，促进淋巴管的生成和血管新生[7]。据研究表明，VEGF-C在肿瘤组织中的表达与淋巴结的转移呈正相关，在宫颈癌中VEGF-C的表达和淋巴结的浸润和淋巴结的转移有关系[8-9]。但是VEGF-C在前哨淋巴结中的作用和其对宫颈癌的影响还尚未清楚，基于此，我们开展了如下研究。

1材料与方法

1.1　临床资料

选取2011年到2013年于我院妇科进行宫颈癌根治术治疗的宫颈癌患者为研究对象，在我们研究中，≥50岁39例，<50岁患者43例；FIGO分期：ⅠB 39例，ⅡA 43例；高/中分化36例，低分化46例；肿瘤直径≥4 cm 35例，<4 cm 47例；鳞癌71例，腺癌11例；淋巴结转移36例，未转移46例。

1.2　方法

1.2.1RT-PCR试剂及方法逆转录试剂盒购自TaKaRa公司，引物VEGF-C.F：5′-AAGGAGGCTGGCAACATAAC-3′，R：5′-CCACATCTGTAGACGGACAC-3′；GAPDH.F：GGTGAAGGTCGGTGTGAACG，R：CTCGCTCCTGGAAGATGGTG合成于Invitrogen，USA。称取等量组织，加入同等比例的Trizol，研磨组织，12 000 r/min，4 ℃离心10 min；吸取上清液至一新的EP管中，静置5 min，使之充分裂解；加入200 μL氯仿，剧烈震荡15 s，然后放置3 min；12 000 r/min，4 ℃离心15 min，离完后分为3层，取最上层(中间一层为蛋白)至一新的EP管中，加入等体积异丙醇，颠倒数次，室温沉淀10 min；12 000 r/min，4 ℃离心10 min，弃上清液；加入75%乙醇(DEPC水溶解)，颠倒数次混匀；7 500 r/min，4 ℃ 5 min，弃上清液，小心吸尽液体(此时可以看到白色沉淀即为RNA)；RNA略干后加入20 μL DEPC水。用TaKaRa公司的逆转录试剂盒逆转录成cDNA。扩增程序为35个循环，程序为95 ℃ 3 min，95 ℃30 s，58 ℃40 s，72 ℃50 s，72 ℃10 min。

1.2.2VEGF-C ELISAHumanVEGF-C ELISA(ELH-VEGF-C)试剂购自于广州瑞博奥生物科技有限公司。准备试剂和标准品。每孔添加100 μl样品和标准品，37 ℃反应90 min，不洗。每孔添加100 μl生物素标记抗体，37 ℃反应60 min。0.01M TBS洗涤3次。每孔添加100 μl ABC，37 ℃反应30 min。0.01M TBS洗涤5次。TMB 37 ℃避光反应30 min以内。加入TMB终止液，读数。

1.3　统计学处理

用SPSS 11.0统计软件包处理，统计学方法采用t检验，Pearson相关分析，χ2检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1　VEGF-C在前哨淋巴结中的表达

在提取组织RNA经由逆转录试剂盒逆转成CDNA后进行RT-PCR分析，在我们所研究的组织中有的组织存在高表达现象，有的存在低表达现象，其中高表达41例，低表达41例，我们规定如图1中1所示为高表达VEGF-C，2所示为低表达VEGF-C。将高表达患者进行统计整理。

1为高表达，2为低表达。

2.2　ELISA进行检测VEGF-C在组织中的表达

上述我们已经证实有些患者组织中会存在VEGF-C mRNA的高表达，紧接着我们进行蛋白水平的检测，在患者组织中我们将提取到的组织蛋白进行ELISA检测，得到标准曲线Y=-1157.2X3+1927.6X2+4680.5X+8.592，根据说明书来看此标曲完全符合，然后将在紫外450 nm处读出数值。正常组织中VEGF-C的正常值为2 459～6 651 pg/mL，将高于此值的我们规定为高表达VEGF-C，共47例，平均值(8258±1430)pg/mL；同理将低于此值的我们规定为低表达组，共35例，(4271±1546)pg/mL。高低表达组患者组织VEGF-C差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3　VEGF-C的表达与患者临床特征的关系

在我们研究中我们将患者中mRNA VEGF-C高表达患者且同时ELISA VEGF-C高表达患者进行病理检查，在我们检查中发现VEGF-C高表达患者与其转移呈正相关，也就是说VEGF-C高表达患者组与低表达VEGF-C患者组相比，发生淋巴结转移更多，将各分类中的VEGF-C阴性与VEGF-C阳性比进行统计，统计得出VEGF-C在未转移患者和转移患者中表达有统计学差异，且P<0.05，具体数据见表1。

表1　VEGF-C在各分类中的表达情况

3　讨论

宫颈癌是人类疾病中恶性程度较高的一类疾病，易发生转移，特别是淋巴结的转移是导致其难治愈的一个主要原因。转移的肿瘤通过血液、淋巴管，进而形成多种其他肿瘤。淋巴管的转移包括一系列的复杂过程，包括①原位癌恶性肿瘤细胞扩散至旁边淋巴管；②肿瘤细胞通过淋巴管转运至邻近的淋巴结；③肿瘤细胞在淋巴结中的着落；④转移性的肿瘤在淋巴结中的扩散[9-10]。

最近的研究多集中在VEGF家族在宫颈癌中的作用，特别是VEGF-C。VEGF-C是在1996年从人前列腺癌PC-3细胞株中分离出来，其位于染色体4q34，在其编码外端有7个外显子，是人类发现的第1个具有促进淋巴管生成的基因[11-12]。VEGF-C具有诱导淋巴管生成和血管新生的潜能，且能调节生理性的和病理性的血管新生，因此VEGF-C在肿瘤发生发展和侵袭浸润中发挥着重要作用[13]。

基于此本研究展开在宫颈癌前哨淋巴结中进行VEGF-C的研究。在我们的研究中我们首先对宫颈癌患者肿瘤组织进行mRNA的检测，进而利用ELISA进行蛋白表达检测，在两项检测均为高表达患者中进行归类，然后进行临床数据的整理，经我们统计分析后发现VEGF-C高的多发生淋巴结转移，表达低的患者多数未发生转移，且具有统计学意义(P=0.046)。所以我们初步得出结论：在宫颈癌转移患者体中VEGF-C表达与淋巴结转移呈正相关。我们认为在今后研究愈加深入后VEGF-C极有可能成为宫颈癌转移的分子标志物。

参考文献

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(编辑：吴小红)

Relationship between VEGF-C Expression and Sentinel Lymph Node

Metastasis of Cervical Cancer

LILin，XINGHui，QINXiaomin，etal.HubeiCentralHospitalofXiangyang，Xiangyang，441021

【Abstract】ObjectiveTo detect the relationship of VEGF-C expression and sentinel lymph node metastasis of cervical cancer.Methods82 cases of cervical cancer were detected by RT-PCR and ELISA，and the expressions of VEGF-C was analyzed.ResultsPatients with high expression of VEGF-C had high lymph node metastasis rate，most patients with low expression of VEGF-C had no lymph node metastasis，there had significant difference(P=0.046).ConclusionThe correlative VEGF-C with lymph node metastasis are positive and VEGF-C may be the molecular markers for cervical cancer.

【Key words】VEGF-C；Cervical cancer；Sentinel lymph node；Metastasis

中图分类号：R737.33

文献标识码：A

文章编号：1001-5930(2016)01-0050-03

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.01.015

通讯作者：周敏

收稿日期(2012-11-12修回日期 2013-05-21)