抑制miRNA-291b-3p表达对H9C2细胞胰岛素信号通路活性的影响

李雪杰，隋小芳，王凤玲，索树珍，杨　军,董文崴，张磊艺

(1.佳木斯大学老年医学研究生；2.佳木斯大学附属第一医院 老年病科；黑龙江 佳木斯154002；

3.佳木斯大学附属第一医院 心内科)



抑制miRNA-291b-3p表达对H9C2细胞胰岛素信号通路活性的影响

李雪杰1，隋小芳2*，王凤玲2，索树珍1，杨军3,董文崴3，张磊艺3

(1.佳木斯大学老年医学研究生；2.佳木斯大学附属第一医院 老年病科；黑龙江 佳木斯154002；

3.佳木斯大学附属第一医院 心内科)

摘要：目的本文探讨抑制miRNA-291b-3p表达在大鼠心肌细胞胰岛素抵抗中的作用，并分析其可能的作用机制。方法①构建miR-291b-3p mimics 和inhibitor 腺病毒载体，感染H9C2细胞48 h，分析miR-291b-3p 水平、AKT/GSK 信号通路活性和糖原水平的变化。②TNF-α刺激心肌细胞24 h后，再用miR-291b-3p inhibitor 腺病毒载体感染H9C2细胞24 h，检测AKT/GSK信号通路活性和细胞糖原水平，验证TNF-α通过影响miR-291b-3p表达水平导致心肌细胞胰岛素抵抗。结果①miR-291b-3p inhibitor腺病毒感染H9C2细胞48 h，miR-291表达水平降低，AKT/GSK信号通路活性升高，心肌细胞糖原水平降低；②低表达miR-291b-3p能够逆转TNF-α引起的AKT/GSK通路活性和糖原水平降低。结论低表达miR-291b-3p可促进AKT/GSK 信号通路活性，并改善TNF-α引起的胰岛素抵抗。

(ChinJLabDiagn,2016,20:0025)

近年研究表明，胰岛素抵抗不仅是2型糖尿病的主要发病机制，糖耐量正常冠心病患者发病的独立危险因素[1]，其机制可能与抑制心肌细胞葡萄糖摄取，改变心肌能量代谢有关。随着对miRNAs的深入研究，越来越多的结果表明，miRNAs广泛参与心血管系统的分化、发育生过程，并调节其生理病理过程[2]。不同miRNA涉及动脉粥样硬化斑块形成、心肌缺血/再灌注损伤、心肌纤维化及心肌肥大、血压调节、心律失常等。miRNA将成为未来心血管病诊断及治疗的全新靶点。

1材料与方法

1.1细胞及主要材料来源

大鼠心肌细胞株H9C2购自中国医学科学院细胞库。H-DMEM 培养基购自Invitrogen公司；胎牛血清购自美国Hyclone公司；TNF-α 购于美国Epitomics公司；一抗购自美国Cell Signaling Technology公司；二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。miR-291b-3p低表达腺病毒载体(AD-291b-3p inhibitor)构建与纯化交由上海吉凯科技有限公司完成。肌、肝糖原检试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2大鼠心肌细胞的培养

将H9c2细胞置于37 ℃、 5%CO2培养箱内，用含10%胎牛血清的H-DMEM培养基培养，在细胞达80%-90%丰度时，以0.25%胰蛋白酶消化，按1：3比例接种于新培养瓶中传代或六孔板中用于实验。

1.3细胞模型的建立

将细胞随机分为四组并接种于6孔板中:阴性对照(NCi)组，AD-291b-3p inhibitor腺病毒感染(291i)组，TNF-α处理(291i+TNF-α)组，TNF-α对照(NCi+ TNF-α)组。

1.4miR-291b-3p表达检测

收集上述前两组处理后的细胞，应用实时荧光定量PT-PCR检测。采用Trizol试剂提取细胞RNA，逆转录 miRNA合成cDNAR，反转录产物采用SYBR Green荧光定量试剂盒和荧光定量PCR仪行PCR。采用△循环阈值(Ct)法处理结果。引物设计如下：

引物名称反转录引物序列5’-3’miR-291b-3pGTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-TCGCACTGGATACGACACAAACU6GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-TCGCACTGGATACGACAAATATG

引物名称PCR引物序列5’-3’miR-291b-3pGCAAAGTGCATCCATTTTGTTTGTU6GCGCTCGTGAAGCGTTCUniverseprimerGTGCAGGGTCCGAGGT

1.5观察miR-291b-3p水平变化对胰岛信号通路及糖原合成的影响

对上述AD-291b-3pinhibitor及其阴性对照、TNF-α处理及对照组，分别处理后，收集细胞，用细胞裂解液提取细胞总蛋白，Western blot检测p-AKT、AKT、p-GSK、GSK水平；按肌、肝糖原检试剂盒说明操作，检测心肌细胞中糖原水平。

1.6统计学分析

数据处理应用SPSS 13.0统计软件进行，采用t检验和单因素方差分析进行统计学分析。可信区间为95%，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1低表达miR-291b-3p增强细胞AKT/GSK 信号通路活性

在H9C2细胞中，我们用AD-291b-3p inhibitor腺病毒感染H9C2细胞48 h。结果显示miR-291b-3p表达水平明显降低(图1A)，AKT和GSK磷酸化水平升高，细胞中糖原水平显著降低(图1B，C)。由此可见，低表达miR-291b-3p能够增强AKT/GSK信号通路活性。

A.miR-291b-3p的表达水平；B.糖原合成水平；C.western blot检测AKT/GSK通路的蛋白水平(n=3,*P<0.5,**<0.01，***<0.001)

2.2抑制miR-291b-3p表达能够逆转TNF-α诱导的心肌胰岛素抵抗

为了证明miR-291b-3p参与TNF-α诱导的胰岛素抵抗，用10 ng/ml TNF-α处理24 h后，AD-291b-3p inhibitor腺病毒感染H9C2细胞48 h，提取细胞总RNA和蛋白，检测AKT/GSK信号通路和糖原水平。 结果显示，低表达miR-291b-3p能够逆转TNF-α对糖原水平的促进作用(图2A)和对AKT/GSK信号通路活性抑制作用(图2B)。由此，说明TNF-α通过调节miR-291b-3p表达水平而影响胰岛素信号通路活性。

A.糖原合成水平；B.western blot检测AKT/GSK通路的蛋白水平(n=3,*P<0.5,**<0.01，***<0.001)

3讨论

目前，学者们主要关注肝脏、骨骼肌和脂肪胰岛素抵抗的作用，少有对心肌细胞胰岛素抵抗相关机制进行研究。而心肌细胞胰岛素抵抗水平同心血管疾病的发生、发展及严重程度密切相关[1]。研究发现，急性心肌缺血时使用胰岛素调节血糖代谢对心脏有保护作用，可减少心肌缺血/在灌注后的损伤[3]。因此改善心肌细胞胰岛素敏感性对维护心肌正常生理功能具有重要作用，可以作为防治胰岛素抵抗相关心血管疾病的手段。

有研究发现[4]，通过激活 PI3K/AKT 信号通路可促进骨骼肌细胞葡萄糖摄取。在我们先前研究中已证实TNF-α引起H9C2细胞中AKT/GSK信号通路活性，升高细胞中糖原水平，且过表达miR-291b-3p与TNF-α结果一致。越来越多的研究表明miRNA 能够广泛参与到胰岛素信号通路[5]以及心血管疾病[6]的调控中，在冠心病发病机制的各个环节中miRNA都发挥作用[7]。miR-291b-3p[8]属于miR-290家族，已有研究证实其参与肝脏胰岛素抵抗的AKT/GSK信号通路，该家族位于染色体7上的2200 bp的碱基片段，可以调控各种细胞信号通路[9]。在本研究中，我们发现在H9C2细胞中过表达miR-291b-3p能够抑制AKT/GSK信号通路活性，升高细胞糖原水平；在H9C2细胞中低表达miR-291b-3p能够增强AKT/GSK信号通路活性，降低细胞糖原水平。说明miR-291b-3p能够调节H9C2细胞发生胰岛素信号敏感性。为了明确miR-291b-3p在TNF-α诱导的细胞胰岛素抵抗中的作用，我们在低表达miR-291b-3p同时用TNF-α处理H9C2细胞，发现抑制miR-291b-3p表达能够逆转TNF-α引起的心肌细胞胰岛素抵抗。进一步说明了，miR-291b-3p确实参与了TNF-α诱导的心肌细胞胰岛素抵抗。

综上所述，在心肌细胞模型上，通过抑制miR-291b-3p表达水平，可增加AKT/GSK信号通路活性，使细胞中糖原合成水平升高。我们将进一步寻找其作用靶基因，并完善体内实验，为胰岛素抵抗相关的心血管疾病的诊断及治疗提供了新的思路。

参考文献：

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[2]Ruiz,M.A.,Chakrabarti,s..MicroRNAs:The Underlying Mediators of Pathogenetic Processes in Vascular Complications of Diabetes[J].Can J Diabetes,2013.37(5):p.399.

[3]赵潇然,张凤如.心肌再灌注损伤的机制与治疗策略[J].国际心血管病杂志，2014,41(3)：158.

[4]Osorio-Fuentealba C，Contreras-Ferrat A E，Altamirano F，et al.Electrical stimuli release ATP to increase GLUT4 translocation and glucose uptake via PI3 Kγ-Akt-AS160 in skeletal muscle cells[J]．Diabetes，2013，62(5):1519．

[5]Pogribny,I.P.and Beland,F.A.,Role of microRNAs in the regulation of drug metabolism and disposition genes in diabetes and liver disease[J].Expert Opin Drug Metab Toxicol,2013.9(6):p.713.

[6]SIMON P R ROMAINE,MACIEJ TOMASZEWSKI,GIANLUIGI CONDORELLI,et al.MicroRNAs in cardiovascular disease:an introduction for clinicians.Heart.2015，101：921-928.

[7]马兰，张基昌，崔燕等.miRNA与冠心病发生发展关系的研究进展[J].中国实验诊断学，2013,17(7)：1354.

[8]Guo J,Li M,Meng XY,etal.MiR-291b-3p induces apoptosis in liver cell line NCTC1469 by reducing the level of RNA-binding protein HuR[J].Cell Physiol Biochem.2014,33:810.

[9]Zheng,G.X.,et al.A latent pro-survival function for the mir-290-295 cluster in mouse embryonic stem cells[J].PLoS Genet,2011.7(5):p.e1002054.

关键词：心肌细胞；胰岛素抵抗；miR-291b-3p；TNF-α

MiR-291b-3p regulates activation of insulin signal pathway in H9C2 cellLIXue-jie1,SUIXiao-fang2*,WANGFeng-ling2,etal.(1.Geriatrics,thefirstAffiliatedHospitalofJiamusiUniversity,postgraduatestudent；2.DepartmentofGeriatrics,thefirstAffiliatedHospitalofJiamusiUniversityHeilongjiangJiamusi154002)

Abstract:ObjectiveOur study aims to identify the role of microRNA-291b-3p in myocardial insulin resistance and the molecular mechanisms.Methods①In order to inhibit miR-291b-3p,H9C2 was infected with AD-291b-3p inhibitor for 48 h.And the level of miR-291b-3p,activation of AKT/GSK pathway and the level of glycogen were analyzed.②H9C2 was treated with10 ng/ml TNF-α for 24 h and then infected with AD-291b-3p inhibitor for 48 h.And the level of miR-291b-3p,activation of AKT/GSK pathway and the level of glycogen were analyzed.Results①In H9C2 cells Infected with AD-miR-291b-3p inhibitor,the levels of miR-291b-3p and glycogen level were decresased and activation of AKT/GSK pathway was promoted.②Down-regulation of miR-291b-3p could revese TNF-α-induced insulin resistance.

ConclusionDown-regulation of miR-291b-3p increased activation of AKT/GSK pathway,and revese TNF-α-induced insulin resistance.

Key words:Myocardial cell,insulin resistance,miR-291b-3p,TNF-α

(收稿日期：2015-08-15)

文献标识码：A

中图分类号：Q781

文章编号：1007-4287(2016)01-0025-04

*通讯作者

基金项目:黑龙江省自然基金面上项目(项目编号：H2015076)；黑龙江省中医药中青年科技攻关项目(项目编号：ZQG-055)；佳木斯大学研究生科技创新项目(项目编号：LM2015_013)