蛋白激酶C-δ特异性脱氧核酶对HepG2细胞生长的影响



蛋白激酶C-δ特异性脱氧核酶对HepG2细胞生长的影响

魏卓1，罗速2*

(1.吉林省人民医院，吉林 长春130021；2.北华大学基础医学院，吉林 吉林132013)

蛋白激酶C(PKC)存在于细胞浆内，是一类由钙激活的磷脂依赖性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，与神经传导、肿瘤生长及细胞生长、分化和凋亡等生理病理过程密切相关。依据对二酰基甘油(DAG)和Ca2+的依赖不同，PKC可以分为传统型(cPKC)、新型PKC(nPKC)和非典型PKC(aPKC)[1-3]三类。蛋白激酶C-δ(PKC-δ)属于nPKC，其激活物是DAG而并非是Ca2+；PKC-δ被激活后可转移至线粒体或细胞膜上，活化并切割半胱天冬酶3(caspase-3)后释放出活性片段，进而使多种底物蛋白磷酸化，使其活化或者失活从而引起细胞凋亡[3-8]。PKC-δ对细胞凋亡的调控具有促凋亡和抗凋亡的双重性。因此，PKC-δ的异常表达或者激活与多种生命现象密切相关，尤其是对肿瘤细胞的凋亡有着非常重要的意义[9]。

脱氧核酶(deoxyribozymes,DRz)是一种新型的基因治疗方法，尤其是10-23型DNAzyme，几乎可以特异性地结合任何靶向RNA[10]，切割位点序列要求非常简单，即嘌呤-嘧啶结构，性质稳定[11-16]。10-23型脱氧核酶结构包括底物结合臂和催化序列两部分，其活性中心由15个脱氧核糖核酸组成，活性中心两侧各有约7-9个核苷酸的底物结合臂，底物结合臂通过Watson2 Crick配对与底物结合后进行底物的定点切割[17-20]。实验设计了针对PKC-δ mRNA的10-23DNAzyme，并对其两端进行硫代化修饰，利用RT-PCR方法扩增PKC-δ的cDNA片段后，将其克隆到pcDNA3.1(+)构建重组质粒，筛选阳性重组质粒后使用T7 RNA聚合酶体外转录获得PKC-δ mRNA表达载体，MTT法检测DRz,DRz-s,和asON 对HepG2.2.15 细胞的生长影响。

1材料与方法

1.1材料

HepG2.2.15肝癌细胞由武汉大学典型培养物保藏中心提供，JM109感受态细胞。T7体外转录试剂盒购自provmega，USA；RT-PCR 试剂盒、MTT试剂、DNA片段纯化试剂盒、质粒DNA小量纯化试剂盒等试剂均购自大连宝生物公司。 MEM培养基是Invitrogen公司产品。

1.2方法

1.2.1PKC-δ mRNA表达载体的构建HepG2.2.15肝癌细胞以含10%胎牛血清(FBS,Gibco)的DMEM(Invitrogen,USA)培养液于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱(Nuaire,USA)中培养。Trizol法(Invitrogen,USA)提取细胞中的总RNA，RT-PCR扩增PKC-δ基因，PCR产物用2%琼脂糖凝胶，于凝胶成像系统中分析、保存图像后将产物纯化并鉴定。用primer5.0软件设计由上海生工合成表1引物，上游和下游分别加入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点。

表1　引物基因序列

将RT-PCR扩增出的PKC-δ cDNA片段，经双酶切后定向克隆入pcDNA3.1(+)质粒的多克隆区T7启动子的下游。EcoRⅠ单酶切线性化PKC-δ重组质粒，T7RNA聚合酶以T7为启动子、以线性化PKC-δ重组质粒为模板体外转录出PKC-δ单链RNA(Invitrogen)。

1.2.2无细胞切割体系DRz对PKC-δ mRNA的催化切割效应及细胞转染DRz、DRz-s、asON由上海生工合成，达到PAGE级纯化标准。基因序列如表2所示。

表2　PKC-δ特异性脱氧核酶基因序列

下划线部分为10-23型脱氧核酶的活性中心。

PKC-δ mRNA和脱氧核酶酶切反应后，7M尿素10%变性聚丙烯酰胺凝胶，凝胶成像系统观察、保存、分析图像。取生长状态好、处于对数生长期的HepG2.2.15细胞，进行DRz 、DRz-s、asON转染，提取总RNA，RT-PCR半定量检测HepG2.2.15细胞中PKC-δmRNA表达水平。MTT法观察脱氧核酶对HepG2.2.15细胞的生长影响，96孔板上方为空白调零，设立阴性对照、转染试剂对照、DRz、DRz-s、asON，共6组，每组10个孔。

2结果

2.1PKC-δ mRNA表达载体检测

总RNA的质量直接关系到RT-PCR实验结果，实验提取的总RNA的结果显示如图1(A)所示，光密度比值A260/280达1.814；琼脂糖凝胶电泳28S、18S、5S条带清晰，因此可作逆转录反应。实验设计引物获得成功，实验结果清晰可见，PKC-δ的RT-PCR电泳结果如图1(B)所示。PKC-δ cDNA片段大小为228 bp，条带大小正确，无非特异性条带，可用于基因克隆。重组质粒的紫外分光光度计测pcDNA3.1(+)-PKC-δ：A260/A280=1.868。pcDNA3.1(+)-PKC-δ经过量的EcoRⅠ单酶切后，如图1(C)所示，电泳结果显示酶切完全，以重组质粒为模板应用PCR反应扩增插入载体的PKC-δ基因片段与扩增获得的片段大小相同。重组质粒的DNA测序结果与理论序列一致，片段大小正确，可见PKC-δ重组质粒构建成功，PKC-δ基因序列准确无误。

2.2脱氧核酶体外切割效应及对HepG2.2.15细胞生长的影响

实验将脱氧核酶对PKC-δ的特异性切割作用进行了检测。利用RT-PCR检测PKC-δ表达，DRz、DRz-s、asON对照组对HepG2.2.15细胞PKC-δ mRNA的影响,可知转染后DRz 、DRz-s能有效降低细胞内的PKC-δmRNA表达，且DRz-s作用稍强，而asON没有降低细胞内的PKC-δ mRNA表达的作用。

图1　(A)总RNA电泳结果;(B)RT-PCR PKC-δ cDNA片段；(C)条带1，pcDNA3.1(+)空质粒3,pcDNA3.1(+) 和 PKC-δ.重组质粒4,EcoR I.重组质粒.

MTT法测定细胞的生长状态，如图2所示。不同试剂转染后不同时间细胞的生长状态。可以看出转染48 h内：阴性对照组、转染试剂组细胞生长缓慢，无明显变化；DRz、DRz-s、asON试剂组较阴性对照组细胞生长旺盛，与asON组相似；DRz和DRz-s组细胞生长速度明显加快，细胞数量较多，状态较好，DRz-s组细胞生长略快。48 h后，阴性对照组、转染试剂和asON组细胞仍然缓慢生长，而DRz和DRz-s组细胞生长速度明显下降。转染96 h后，各组细胞生长速度几乎相同。

图2　培养 HepG2.2.15细胞与DRz,DRz-s and asON不同

3讨论

脱氧核酶对底物RNA的催化活性取决于脱氧核酶的设计，DRz、DRz-s具有催化切割底物RNA的特异作用。分析原因其GC含量适宜，结合臂9nt属于催化效率最强的长度，且处于易于被脱氧核酶接近的位置，能与PKC-δ上的DNA位点发生特异性的结合，通过竞争作用而阻碍基因启动区上位点的结合，在信号转导中阻断PKC-δ的活化，阻滞进一步信号传导过程，使抑癌基因表达受到抑制。对DRz 5′和3′端的两个磷酸二酯键进行硫代修饰形成DRz-s，在一定程度上稳定性提高而又能保持DRz的大部分剪切活性。为了证明DRz对PKC-δ表达的抑制效应并非完全源自其识别序列的反义效应，实验设计了与DRz底物识别序列一致的反义寡聚核苷酸asON作为对照。结果显示asON无催化切割作用。这表明基因表达的阻断效应不是以其识别序列的反义效应所致，而是由于DRz对底物PKC-δ RNA的特异性切割所致。

DRz、DRz-s均能有效降低HepG2.2.15细胞内PKC-δmRNA表达，且DRz-s作用更强，说明硫代修饰后的DRz-s能提高抗核酸酶降解的能力，所以具有更高的切割作用。asON作用远不及DRz、DRz-s，说明其有封闭作用但无切割效果。MTT实验结果表明脱氧核酶抑制PKC-δ基因表达呈现时间依赖趋势。当PKC-δ基因的表达受到抑制后，其抑癌活性消失，癌细胞生长旺盛，但是脱氧核酶对PKC-δ基因的表达抑制作用并不是持续不变的。随着时间的延长，这种抑制作用逐渐减弱。

本实验DRz特异性地切割PKC-δ后，PKC-δ表达受到抑制，其活性消失(包含去磷酸化作用)，不能发挥肿瘤抑制因子的功能，肝癌细胞则加速生长。说明作为PKC家族重要成员的PKC-δ在肝癌发生发展的过程中起着重要的调控作用。可能成为肝癌基因替代治疗的药物，具体的分子机制还需进一步探索。

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(收稿日期：2015-06-19)

作者简介：魏卓，女，吉林省长春市人，硕士研究生，中级检验师。罗速，女，博士，教授，硕士生导师，北华大学 生物化学与分子生物学教研室。

文章编号：1007-4287(2016)01-0028-04

*通讯作者

基金项目：吉林省卫生计生青年科研课题(2014Q009)