大豆C2H2型锌指蛋白基因STF—2的克隆及结构分析

宋冰++付永平+李勃++赵海涛++李丹++王丕武

摘 要：大豆是我国重要的粮油经济作物，是众多行业中必需的原材料。锌指蛋白是一种重要的转录因子，其中双锌指的植物C2H2型锌指蛋白多数与植物的非生物胁迫相关，可以利用生物技术手段提高作物对非生物胁迫的耐受能力。该文利用生物信息学和同源克隆的方法克隆得到了大豆C2H2型锌指蛋白基因STF-2，并且利用软件对其蛋白结构进行了初步分析。

关键词：大豆；锌指蛋白；STF-2；结构分析

中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2016）03-04-18-03

Cloning and Structural Analysis of STF-2 Encoding a C2H2-type Zinc Finger Protein from Soybean

Song Bing1，2 et al.

（1Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China；2Jilin City Academy of Agricultural Sciences，Jilin 132101，China）

Abstract：Soybean（Glycine max[L.]Merrill）is the important food and oil crops of China which is the important raw materials of many industries.The zinc protein was an important transcription factors，and most plant C2H2-type zinc finger protein with the double zinc-finger structures related with adversity stress.It will offer a favorable condition to enhance the plants tolerance to adversity stress by the biotechnology. In this paper，a C2H2-type zinc finger protein gene STF-2 was isolated from soybean，and analyzed primary structure of the STF-2 by software.

Key words：Soybean；Zinc finger protein；STF-2；structural analysis

干旱、高盐、低温是限制植物生长发育的不利环境因子[1]。锌指蛋白是转录因子的一种，其对植物的生长发育和非生物胁迫有着重要作用。根据以往的锌指蛋白结构分析结果，可将锌指蛋白分为C4、C2H2、C6、C4HC3等类型，其中大部分类型的锌指蛋白都属于C2H2型[2-3]。科学家们已从拟南芥（Arabidopsis thaliana）、矮牵牛（Petuniahy brida Vilm）以及水稻（Oryzas ativa）等植物中克隆得到了多个与植物非生物胁迫相关的C2H2型锌指蛋白基因。例如，能使转基因烟草明显提高对冷及高盐耐受能力的拟南芥STZ基因[3，4]；能提升耐旱能力的矮牵牛基因ZPT2-3；张红生等克隆得到的水稻锌指蛋白基因RZF71、RZF5，能够提高转基因作物对渗透胁迫的耐受能力[3，5-6]；能提高转基因拟南芥对低温的耐受能力的大豆锌指蛋白基因sCOF-1[7]。相比之下，从拟南芥、水稻、矮牵牛等作物中克隆得到的锌指蛋白基因均有10个左右，而得到功能验证的大豆锌指蛋白基因只有SCOF-1；GmZFP1是黄芳等克隆得到一个新的大豆C2H2型锌指蛋白基因，分析后发现其只有一个锌指结构，推测与大豆的生长发育相关，与非生物胁迫无关[3，8]；白晶等从野生大豆中克隆得到了一个双锌指的C2H2型锌指蛋白基因，但其氨基酸和核酸序列与sCOF-1同源性较高，且没有进行相应的功能验证[9]。本文利用大豆基因组数据库和相关生物信息学软件，采用同源克隆的方法克隆得到了一个新的大豆C2H2型锌指蛋白基因STF-2（GeneBank注册号为：JQ74388），并利用生物信息学软件对其蛋白结构进行了初步分析。

1 材料和方法

1.1 试验材料与试剂 选用本实验室自有品种“吉农17”的种子，单粒种植于纸杯中，放入的气候箱（15h光照/9h黑暗）中25℃培养10d至4叶期，随后连续7d不予浇水进行模拟干旱胁迫[3]，摘取处理后的大豆叶片，将其放入1.5mL离心管中，再放入液氮中以备大豆总RNA的提取。试验中所用的RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、克隆载体pMD18-T均购自大连宝生物（TaKaRa）公司，目的基因的引物序列由上海（生工）生物工程公司合成，大肠杆菌E.colid H5α购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取和cDNA第一链的合成 将之前液氮冻存在离心管中的大豆叶片样品研磨粉碎，利用吸附柱式RNA提取试剂盒提取大豆的总RNA，再利用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA第一链，-20℃冰箱中保存备用[3]。

1.2.2 目的基因STF-2的克隆 利用已知的SCOF-1的氨基酸序列为信息探针，在GeneBank中运行tBlastn程序搜索对应的氨基酸序列，从中预测出若干具有C2H2型锌指蛋白结构的大豆基因序列，本文选择了一个命名为STF-2的基因进行克隆和相关蛋白结构分析。根据搜索出的cDNA序列再结合EST标签库中的数据，利用软件拼接得到STF-2的基因序列，以其为模板设计引物：STF-2F（5'-GCTCATCTACACTCATA-3'），STF-2R（5'-TGATGAAAACAATTGTTA-3'）用于后续的基因克隆。使用之前反转录得到的cDNA为模板进行RT-PCR扩增，克隆目的基因，PCR反应程序如下：94℃预变性5min，94℃变性45s，48℃复性50s，72℃延伸50s，共进行32个循环，72℃后延伸10min，4℃保存[3]。经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后，将PCR产物回收纯化后连接至pMD-18T载体上，再转化到大肠杆菌E.colid H5α中，之后将菌液送由上海生工公司进行测序。

1.2.3 染色体定位及蛋白结构初步分析 利用软件primer5.5对目的基因STF-2的引物序列进行设计和分析，多个氨基酸序列的比较和系统发生树采用的软件是DNAMAN6.0和MEGA5.0。目的基因的染色体定位程序如下：首先，以STF-2的cDNA序列为搜索模板，在大豆基因组数据库（http：//www.soybase.org）中运行blast程序进行比对，搜索得到目的基因在基因组中的具体位置，再分析目的基因在染色体上的遗传距离，最后，根据染色体的物理图谱将目的基因准确的定位在大豆染色体上。利用在线生物信息学软件InterProScan对蛋白的二级结构进行了分析[3]。

2 结果与分析

2.1 STF-2基因的克隆和染色体定位 根据软件预测和拼接的STF-2的cDNA序列设计特异引物，利用RT-PCR的方法从大豆品种“吉农17”中得到了大豆C2H2型锌指蛋白基因STF-2，并用ORF Finder程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/）分析目标序列确定其完整的开放阅读框为747bp，如图1。利用DNAMAN6.0分析其氨基酸序列，发现STF-2共编码249个氨基酸，预测其等电点pI=8.23，分子量MW=26.7kDa。大豆基因组数据库（http：//www.soybase.org）进行blast比对，发现STF-2基因定位在大豆第10（O）条染色体的长臂上，目的基因全序列都包含在一个编号为Glyma10g40400的序列之中，软件也自动预测此基因序列编码一个未知的C2H2型锌指蛋白，其遗传距离为117.2cm，再根据此序列的遗传距离在10号染色体物理图谱中确定其具体的位置，如图2[3]。

2.2 STF-2蛋白的一级和二级结构分析 利用生物信息学软件DNAMAN7.0将STF-2及水稻、拟南芥、矮牵牛、辣椒及大豆中典型的C2H2型锌指蛋白的氨基酸序列进行多序列比对分析，结果表明，STF-2蛋白具有2个锌指蛋白结构域，且两锌指间相隔36个氨基酸残基，并且氨基酸序列特征符合典型锌指结构所具有的氨基酸序列分布规律：Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X3-His，锌指结构中都含有植物特有且保守的氨基酸序列QALGGH[3]。通过对氨基酸组成结构的分析表明，STF-2蛋白具有典型的植物C2H2型功能结构域，含有一个与亚细胞定位有关的核定位信号区NLS（也称B-box），一个富含Leu的L-box，靠近C端的的DLN-box[10，11]，如图3。利用MEGA5.0构建出STF-2和其他典型的植物C2H2锌指蛋白的系统分化树，可以看出大豆锌指蛋白STF-2与SCOF-1、ZPT2-1、ZPT2-3等锌指蛋白均属于含有2个锌指结构的植物C2H2型锌指蛋白，这些典型的的植物C2H2型锌指蛋白基因都与植物的非生物胁迫相关，且都具有双锌指结构，因此推测STF-2可能也与大豆非生物胁迫下的表达有关[3]，而STOP1、KNU等均为单锌指的植物C2H2型锌指蛋白，其大多与植物的生长发育相关，如图4。利用InterProScan软件对STF-2的二级结构进行了预测分析，通过对其蛋白的保守区域的分析发现，其具有2个保守的锌指结构，红色框选部位为其保守区域，更证实其为双锌指结构的锌指蛋白，如图5。

3 讨论

STF-2基因是通过同源克隆的方法获得的，根据以往的报道，大多数植物C2H2型锌指蛋白都没有内含子，经过测序分析后发现STF-2也没有内含子[3，12]。通过各锌指蛋白的氨基酸序列分析可以看出，STF-2氨基酸序列中具有2个典型的锌指结构，且其中都含有典型的植物所特有的氨基酸保守序列QALGGH，虽然STF-2基因与SCOF-1基因都来源于同一种作物，但二者的核酸序列相似性仅为54.35%，氨基酸相似性为44.31%。除了2个锌指结构外还有着相同的功能结构域：与亚细胞定位有关的核定位信号区NLS（也称B-box），富含Leu的L-box，与转录抑制活性相关的DLN-box，更可以证明STF-2是一个新的大豆C2H2型锌指蛋白基因。通过对STF-2二级结构的分析表明，其2个锌指结构均由α螺旋和β折叠围绕一个锌离子构成。锌指蛋白作为转录因子起到调控作用，主要通过锌指结构与DNA相结合，再调控下游基因的表达；经过电荷分布情况的分析表明，STF-2的锌指结构带有负电荷，而DNA具有正电荷，表明其可以与DNA相结合，这也是锌指蛋白发挥作用的基础，这一结果也与以往的报道相符[12]。

已知的植物C2H2型锌指蛋白一部分类型参与了植物生长周期中的表达调控，另一部分则与逆境胁迫下基因的表达调控有关。根据以往的研究可知：具有1个锌指结构的植物C2H2型锌指蛋白与植物的生长发育，尤其是生殖器官的发育有关，如典型的单锌指基因SUPERMAN、PhSUPI、KNU等，而具有2个锌指结构的植物C2H2型锌指蛋白大多与各种非生物胁迫相关[3，11]，如典型的植物双锌指基因STZ/ZAT10、ZPT2-2、ZPT2-3、SCOF-1等[3，13]。研究人员发现：在干旱胁迫下，矮牵牛ZPT2-2被诱导表达，从而提高了转基因植物的抗旱性。根据ZPT2-2的氨基酸序列进行同源性比对，科学家分离得到了ZPT2-3，经过试验分析表明，ZPT2-3受低温，干旱、茉莉酸和重金属诱导并不受ABA诱导，且转ZPT2-3基因的矮牵牛在20%的PEG6000溶液胁迫处理下，比对照表现出明显的抗旱性[3，12]；系统进化树进一步表明，STF-2基因与ZPT2-3、STZ、ZPT2-3、SCOF-1基因的都同属双锌指结构的植物C2H2型锌指蛋白，软件分析表明它们都具有相同的功能结构域，因此推测STF-2是与非生物胁迫相关的C2H2型锌指蛋白基因。研究表明，SCOF-1基因表达后，通过SGBF-1介导调控COR（低温调控基因）的表达来提升转基因植物的耐冷性[3，7]，但STF-2的调控机制还不清楚，具体的调控路径和生物学功能还需要作进一步的研究分析。

参考文献

[1]Shinozaki K，Yamaguchi-Shinozaki K，Seki M.Regulatory network of gene expression in the drought and coldstress responses[J].Curr Opin Plant Biol.，2003，6：410-417.

[2]Iuchis.Three Classes of C2H2 zinc finger proteins[J].Cell Mol Life Sci.，2001，58（4）.

[3]宋冰.大豆C2H2型锌指蛋白基因SCTF-1、STF-2、STF-3的克隆及功能分析[D].长春：吉林农业大学，2012.

[4]Sakamotoh，Araki T，Meshi T，et al.Expression of asubset of the Arabidopsis Cys（2）/His（2）-type zinc-finger protein gene family under waterstress[J].Gene.，2000，248：23-32.

[5]郭书巧，黄骥，江燕，等.水稻C2H2型锌指蛋白基因RZF71的克隆与表达分析[J].遗传，2007，29：607-618.

[6]郭书巧，张红生.水稻锌指蛋白基因RZF5和RZF71的克隆与功能分析[D].南京：南京农业大学，2006：23-120.

[7]Kim J C，Leesh，Cheong Yh，et al.A novel cold-inducible zinc finger protein fromsoybean，SCOF-1，enhances cold tolerance in transgenic plants[J].Plant J.，2001，25：247-259.

[8]Huang F，Chi Y G，Meng QC，et al.GmZFP1 encoding asingle zinc finger protein is expressed with enhancement in reproductive organs and lateseeddevelopment insoybean（Glycine max）[J].Molecular Biology Reports，33（4）：279-285.

[9]白晶，张必弦，李新玲，等.野生大豆（Glycinesoja）C2H2型锌指蛋白基因的克隆与序列分析[J].大豆科学，2009，28（1）：21-25.

[10]Huang J，Wang J F，Wang Qh，et al.Identification of a rice zinc finger protein whose expression is transiently induced bydrought，cold but not bysalinity and abscisic acid[J].DNAseq，2005，16（2）：130-136.

[11]Huang J，Yang X，Wang M M，et al.A novel rice C2H2-type zinc finger protein lackingdLN-box/EAR-motif plays a role insalt tolerance[J].Biochim Biophy Acts.，2007，1769：220-227.

[12]宋冰，洪洋，王丕武，等.植物C2H2型锌指蛋白的研究进展[J].基因组学与应用生物学，2010，29（5）：1133-1141.

[13]黄骥，张红生.TFⅢA 型锌指蛋白及在提高植物耐逆性中的作用[J].遗传，2007，29（8）：915-922.

（责编：张宏民）