黄金茶提取物对中波紫外线损伤HaCaT细胞的保护作用研究

马蕊，古能平，阳琼芳，林勇，刘仲华*

（1.广西职业技术学院，广西南宁 530226；2.湖南农业大学茶学教育部重点实验室，湖南长沙 410128）

黄金茶提取物对中波紫外线损伤HaCaT细胞的保护作用研究

马蕊1，古能平1，阳琼芳1，林勇2，刘仲华2*

（1.广西职业技术学院，广西南宁 530226；2.湖南农业大学茶学教育部重点实验室，湖南长沙 410128）

为了考察黄金茶提取物防治中波紫外线（UVB）对人表皮角质形成细胞损伤作用，采用不同浓度的黄金茶提取物对HaCaT细胞进行预处理6 h，采用60 m J·cm2的剂量照射细胞，以MTT法检测细胞生存率，吸取细胞上清液检测谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶（SOD）和乳酸脱氢酶（LDH）活性以及丙二醛（MDA）含量变化，用流式细胞仪检测细胞凋亡变化。结果表明，UVB辐射对HaCaT细胞造成严重损伤，黄金茶提取物可提高UVB照射后HaCaT细胞的存活率，提高GSH-Px、SOD活性，降低LDH活性和MDA含量，同时黄金茶提取物能够降低UVB所引起的细胞凋亡率升高（P<0.01），还可以减少UVB诱导HaCaT细胞损伤或凋亡，具有一定的光保护功能，其作用机制可能与清除氧自由基和增强抗氧化能力有关。

黄金茶提取物；中波紫外线；HaCaT细胞；氧化损伤；凋亡

皮肤光老化现象的产生是由于经受长期过度的紫外线辐射，从而刺激皮肤中色基或光敏物质增加，引发自由基大量产生，破坏自身的抗氧化体系，细胞膜损伤，脂质过氧化产物堆积，加速皮肤衰老形成的[1]。甚至自由基的过度产生还可能诱导DNA转化为嘧啶二聚物，出现DNA链断裂或碱基氧化，诱导细胞损伤或凋亡，发生免疫受阻、皮肤癌变等疾病[2-3]。中波紫外线（UVB）照射是导致人表皮角质形成细胞凋亡，造成皮肤癌发生的主要因素[4]。使用抗氧化剂预防和减轻UVB照射形成的光损伤已经成为当今研究热点。研究证明，茶叶中表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）具有抑制中波紫外线诱导HaCaT细胞氧化损伤的效果[4]，而黄金茶及黄金茶提取物中含有大量的茶多酚类物质，具有抵抗紫外线辐射的作用。本试验研究采用UVB照射建立人表皮角质形成细胞（HaCaT）体外光损伤模型，考察黄金茶提取物对紫外线诱导皮肤光老化的防治作用。

1 材料、仪器和方法

1.1 实验材料

人表皮角质形成细胞HaCaT（由武汉大学中国典型培养物保藏中心培育）；黄金茶提取物（使用湖南省保靖县黄金茶）；MEM培养基、胰蛋白酶和胎牛血清（美国Gibco公司）；PBS粉剂、四甲基偶氮唑蓝（MTT）粉和二甲基亚砜（DMSO）（美国Sigma公司）；谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；细胞凋亡检测试剂盒 （南京凯基生物科技发展有限公司）。

1.2 实验仪器

CO2培养箱（美国Nuaire）；倒置显微镜（德国Leica）；紫外交联仪（英国UVP）；紫外分光光度计（日本Shimadzu公司）；多功能酶标仪（Thermo公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养、模型建立及给药分组

细胞培养、细胞光损伤模型建立参照林勇[4]等、马蕊[5-6]等和刘硕[7]等的报道。给药剂量如下：正常组、模型组（HaCaT细胞给予MEM完全培养基培育6 h）；黄金茶给药组（分别给予含黄金茶提取物的MEM完全培养基培育6 h，药物浓度分别为

2.5 μg/mL、5.0μg/mL、10μg/mL）。

1.3.2 检测方法

MTT法测定 HaCaT细胞增殖活性参照文献[4-7]中的方法进行。抗氧化指标（GSH-Px、SOD、MDA和LDH含量）以及细胞凋亡率等测定方法按照试剂盒说明书进行。

1.3.3 数据统计分析

以SPSS20.0 for windows统计软件进行数据分析。

2 结果

2.1 黄金茶提取物对UVB照射HaCaT细胞存活情况的影响

如表1所示，模型组与正常组相比，其细胞活性较低，具有显著性差异（P＜0.01）。加入含浓度为2.5~10μg/mL黄金茶提取物的培养基孵育6 h再接受UVB辐射（采用60 mJ·cm2的剂量），均具有提高细胞存活率的作用，加入浓度为10μg/mL效果较明显，与模型组有显著差异（P＜0.01）。

表1 黄金茶提取物对UVB照射HaCaT细胞存活情况的影响Table 1 EffectofHuangjin tea on survivalability ofUVB irradiated HaCaT cells

2.2 黄金茶提取物对UVB辐射 HaCaT细胞GSH-Px、SOD和MDA含量的影响

抗氧化指标测定结果显示（见表2），经UVB照射，脂质过氧化产物MDA含量较正常组显著升高，而GSH-Px和SOD的活力显著降低，差异具有统计学意义（P<0.01），说明破坏了HaCaT细胞自身的抗氧化能力。而与模型组相比，经6 h黄金茶提取物预孵育的给药组其GSH-Px和SOD活力均有提高，而MDA含量下降，呈现出一定的剂量关系，达到极显著水平（P<0.01）。

表2 黄金茶提取物对UVB照射HaCaT细胞GSH-Px、SOD和MDA含量的影响Table 2 EffectofHuangjin tea on GSH-Px、SOD and MDA contentofUVB irradiated HaCaT cells

2.3 黄金茶提取物对 UVB辐射 HaCaT细胞LDH活性的影响

与正常组相比，模型组细胞培养基中LDH活性明显升高，二者具有显著性差异（P<0.01）。黄金茶给药组与模型组相比，细胞培养基中LDH活性显著降低（见表3）。

表3 黄金茶对UVB照射HaCaT细胞LDH的影响Table 3 EffectofHuangjin tea on LDH ability ofUVB irradiated HaCaT cells

2.4 黄金茶提取物对UVB辐射HaCaT细胞凋亡情况的影响

人表皮角质形成细胞 （HaCaT）受辐射处理后经流式细胞凋亡检测发现 （见图1），正常组的正常细胞占91.42% （见图1—A），模型组占7 4.03%，黄金茶提取物预处理的给药组占80.38%。由此可见，与正常组相比，经UVB辐射的模型组HaCaT细胞存活率下降19.02%，而经过10μg/mL黄金茶提取物孵育的HaCaT细胞存活率下降12.08%，使细胞存活率提高了6.94%，与表1结果相符，说明黄金茶可以有效地抵抗紫外辐射损伤。

3 讨论

长期紫外线辐射后，机体会出现氧化和抗氧化能力失衡，产生对自身有害的氧自由基，程度不断加深，皮肤抗氧化系统瓦解[8]，破坏细胞膜的脂质结构，通透性变大，并导致脂质过氧化，干扰机体正常的代谢活动，并可能诱发突变、阻滞细胞周期活动、引起细胞凋亡、诱发皮肤癌产生。而机体本身存在由GSH-Px和SOD等构成的抗氧化酶系统，减少氧自由基的产生，防御氧化损伤。但当外界不良刺激大量产生，诱发氧自由基过度产生时，抗氧化物酶就会失去活性，导致氧化产物MDA增加，细胞膜被破坏，出现细胞损伤或凋亡[9]。本实验结果显示，黄金茶提取物可以提升GSH-Px、SOD活力，延缓并清除氧自由基的产生，改善脂质过氧化损伤程度，降低LDH的活性，维持了细胞膜的构造和功能的完整性。因此，黄金茶提取物可以抑制UVB辐射引起的细胞氧化损伤和凋亡，有益于人皮肤光老化的保护。

图1 黄金茶对UVB辐射HaCaT细胞凋亡情况的影响Fig.1 Effect of Huangjin tea on the apoptosis of UVB irradiated HaCaT cells

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Photo-Protection of Huangjin Tea Extracts on HaCaT Cell From Ultraviolet B-Induced Damage

MA Rui1，GU Neng-ping1，YANGQiong-fang1，LIN Yong2，LIU Zhong-hua2*

(1.Guangxi Vocational&Technical College,Nanning 530226,China;
2.Key Lab of Tea Science of Ministry of Education,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China)

In order to investigate the photo-protective effect of Huangjin tea extracts on HaCaT cells damaged from ultraviolet B radiation,sub-confluent HaCaT cellswere incubated for six hourswith different doses of Huangjin tea extracts,and then irradiated with 60 mJ·cm2doses of UVB irradiation.The cell viability was detected by MTT method.The activity of superoxide dismutase (SOD),glutathione peroxidase (GSH-Px)and lactate dehydrogenase (LDH),and the level ofmalondialdehyde(MDA)of supernatantwere detected with colorimetricmethods.Annexin V/ PI double staining was performed to evaluate the change of apoptosis using flow cytometry.Results show the cell viability was inverse correlating with the irradiated dosage.Huangjin tea extracts could enhance the cell viability, SOD and GSH-Px activity of supernatant under UVB irradiation,decrease the activity of LDH and the content of MDA in dose-dependentmanner.Compared with UVB irradiatedmodel group,the apoptosis rate of pretreated HaCaT cell was decreased （P<0.01）.Conclusion Huangjin tea extracts could relieve the oxidation cell damaged and apoptosis from UVB irradiation to HaCaT cells.Huangjin tea extracts had the function of photo-protection by clearing the oxyradical and raising the oxidase activity.

Huangjin tea extracts;Ultraviolet B;HaCaT cell;Oxidative damage;Apoptosis

S571.1；R329.2+5

A

2095-0306（2016）05-0031-04

中国茶叶加工 2016（5）:31-34

2016-07-04

马蕊（1987-），女，黑龙江黑河人，讲师，主要研究方向为茶叶加工及植物功能成分化学。

*通讯作者：larkin-liu@163.com