云南省肠道病毒EV71基因序列特征分析

段星娥 杨红润

【摘要】目的 利用分子生物学方法研究云南省肠道病毒EV71基因序列特征。方法 采集患儿发病7天内的粪便样本，经生物公司试剂盒验证为EV71感染，设计合成8对引物扩增合成，扩增产物经测序后拼接，对拼接结果进行分析，并与其他已发表的EV71全基因组序列进行同源性对比；构建系统进化树。结果 得到了云南省EV71全基因序列。结论 通过测序结果分析确定EV71病毒株与上海、北京、杭州EV71病毒株亲缘关系最接近，同属于C3亚型

【中图分类号】R-1 【文献标识码】B 【文章编号】1671-8801（2016）01-0181-02

手足口病（Hand foot mouth disease ， HFMD） 是婴幼儿常见的传染病，由肠道病毒引起，临床上以发热和手、足、口腔等部位出现皮疹、溃疡等表现为主，个别患者可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症。

引起本病的肠道病毒有20 多种（型），均属微小核糖核酸病毒科、人肠道病毒属。其中柯萨奇病毒（Coxasckievirus） A16 型（CoxA16） 和肠道病毒71 型（ Enterovirus71，EV71） 最常见。有关EV71 感染的报道始于20 世纪70 年代初，1969 年EV71 型在美国被首次确认。此后，EV71 感染与CA16 感染交替出现，成为手足口病的主要病原体。2008年来全国多个省份暴发儿童手足口病，云南地区手足口病例数亦呈骤增趋势，手足口病治疗和预防任务十分艰巨，掌握云南地区儿童手足口病的病原体分子生物学资料刻不容缓。

一、材料与方法

1.1. 样本采集

收集医院手足口病患儿粪便样本，于病人发病7天内采集，5～8g/份，采集后立即放入无菌采便管保存。

1.2. 临床样本鉴定

采用中山大学达安基因股份有限公司肠道病毒71型核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）检测临床样本，确定其为含有EV71病毒株。具体步骤参照试剂盒说明书。

1.3. RNA提取 采用离心柱法试剂盒提取，试剂盒购自北京天根，方法参考说明书进行。

1.4. 引物设计与合成

参考NCBI发表的EV71病毒株（登录号：HQ423143.1）以及Cox.A16病毒株（登录号： HQ423141.1）序列设计引物。引物设计使用Primer Premier 5.0，引物质量分析使用 Oligo 6.0。具体引物序列见表1。

1.5 . cDNA的合成利用试剂盒完成，试剂盒购自北京天根，方法参考说明书进行。

1.6. RT-PCR反：利用试剂盒完成，试剂盒购自北京天根，方法参考说明书进行。

1.7. 扩增产物利用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（TIANGEN Midi Purification Kit），按说明书方法进行片段的回收和纯化。回收完后送上海生工生物工程有限公司测序，将得到的测序结果去载体序列后利用DANstar软件进行拼接。对拼接结果进行序列分析。

二、结果

2.1. EV71测序结果

经过测序、 序列拼接和分析，获得EV71病毒株全基因组核苷酸序列（未包括多聚腺苷酸尾） 长度为 7416 bp， 其中A 占 27. 0% ， G 占 24.0%， C 占24. 4% ， T 占24 .6%，其中 A + T= 51. 6%含量丰富。5端非编码区（ 5U TR） 长 753bp；病毒基因组编码区全长 6 582 个核苷酸，编码含2194个氨基酸残基的多聚蛋白； 3端非编码区末端长81 bp。

2.2. 氨基酸序列

根据拼接得到的EV71全基因组序列进行结构分析。具体结果见表2

本次测序得到的EV71病毒株基因组的特征和结构符合肠道病毒，与EV71 国际标准株BrCr（ U22521）核苷酸同源性为80%， 氨基酸同源性为90.3%。

2.3. 进化树分析

用DNAstar中的 Megalign 软件，对本次测序EV71 的VP1序列与取自 GenBank 的其它 EV71 毒株VP1序列进行遗传进化分析。结果见下图。

EV71为本次测序病毒株；HM002489为北京EV71病毒株；HQ891923、HQ891924上海EV71病毒株；FJ158601杭州EV71病毒株；EU703813安徽EV71病毒株；GU459070昆明 EV71病毒株；JF913464济南EV71病毒株；JN001860宁波EV71病毒株；GQ892830南京EV71病毒株；AB550338日本东京EV71病毒株

三、讨论

根据报道，EV 71 型的基因组为约含7 408 个核苷酸的单股正链 RNA， 基因组中仅有 1 个开放阅读框（ ORF ） ， 编码含 2 194 个氨基酸的多聚蛋白（ po lyprotein） ，在其两侧分别为5非编码区（ UTR）和3 非编码区。在3非编码的末端含有1 个长度可变多聚腺苷酸尾（ polyA） ， 而其5 末端共价结合有1个小分子量蛋白（ VPg）。P1 区编码外壳蛋白的前体蛋白，经一系列的加工形成病毒外壳蛋白 V P1，VP2， VP3 及VP4。P2 和P3 区主要编码蛋白水解酶及 RNA 聚合酶， 在进化过程中高度保守。根据病毒衣壳蛋白VP1核苷酸序列的差异， 可将EV 71 分为A、 B、 C 共3 个基因型。A基因型只包含一个单独的病毒株BrCr；B基因型可进一步分为5个亚型，B1、B2、B3、B4、B5；C基因型也分为5个亚型，Cl、C2、C3、C4、C5。同一基因型内，核营酸差异为12%，不同基因型之间核普酸的差异为16.5%-19.7%。本次所测的EV71病毒株与上海EV71病毒株（登录号：HQ891923、HQ891924）、北京EV71病毒株（登录号：HM002489）、杭州EV71病毒株（登录号：FJ158601）等病毒株同源性>90%；VP1区与这些病毒株的VP1区核苷酸同源性均>98%。由此可知，不论从全基因组还是VP1区的进化分析都表明本次测序得到的EV71病毒株属于C3亚型。

参考文献：

[1] 周世力， 李琳琳， 何雅青， 等. 我国分离的肠道病毒71 型（ SHZH03病毒株）全基因组核苷酸序列分析. 病毒学报， 2004，20： 7211.

[2] 陈立， 李秀珠， 张礼壁， 等. 一起引发手足口病流行的肠道病毒71 型的分子特征[J ]. 中国计划免疫，2003 ，9（5） ：283 - 287.