杏鲍菇生产包黑斑病害菌分析

姚璐晔，沈金波，裴丹丹，孙丹凤，冀宏（常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏常熟215500）



杏鲍菇生产包黑斑病害菌分析

姚璐晔，沈金波，裴丹丹，孙丹凤，冀宏
（常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏常熟215500）

摘要：杏鲍菇生产厂的部分菌丝生产包出现黑斑，从中分离纯化得到病害菌（130305S），结合显微结构和生理生化试验结果，以及对其16SrDNA序列的分析确定病害菌的系统发育地位；通过人工回染试验确定分离得到的病害菌与黑斑出现的相关性。结果表明：菌株130305S鉴定为巨大芽孢杆菌属（Bacillus megaterium）；人工回染试验证实菌株130305S可导致生产包出现黑斑，菌丝不生长的污染症状。

关键词：杏鲍菇；黑斑；病害菌；巨大芽孢杆菌；人工回染

杏鲍菇（Pleurotus eryngii）又名刺芹侧耳，隶属于担子菌亚门（Basidio mycotina），层菌纲（Hymenom ycetes），无隔担子菌亚纲（Homobasidiomycetidae），伞菌目（Agaricades），侧耳科（Pleurotaceae），侧耳属（Pleuroyus）。杏鲍菇菌肉肥厚，营养丰富，具有杏仁香味和鲍鱼味，故称杏仁鲍鱼菇。上世纪九十年代，美国、日本、我国等采用调温、调湿的自动化生产工艺进行试验性栽培，取得了成功[1]。近年来，杏鲍菇工厂化生产过程经常出现严重的细菌性污染，导致生产出现严重的损失[2-9]。我国食用菌病害的研究基础薄弱，对食用菌病害的病原菌认识不清，且随着食用菌栽培技术的日趋成熟与周年化生产的实现，迫切需要对食用菌病害菌进行深入研究，以减少病害造成的经济损失及保障食用菌产品的安全。

本研究以昆山一家杏鲍菇生产厂常出现的生产包黑斑为研究对象，对其进行分离纯化培养，并依据菌落特征、生理生化试验及分子生物学手段对分离得到的病原菌进行种属鉴定，并通过人工回染实验验证病害菌与污染特征的相关性。

1材料与方法

1.1材料与培养基

污染杏鲍菇生产包样本：昆山振兴食用菌有限公司。

牛肉膏蛋白胨培养基（g/L）：牛肉膏3，NaCl 5，蛋白胨10，pH7.2~7.4。

1.2仪器与设备

M124A电子天平：伯拉莫贝林（上海）精密仪器有限公司；FE20便携式（数显）pH计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；CJ-2S超净工作台：天津泰斯特仪器有限公司；ZQWY-200G振荡培养箱：上海知楚仪器有限公司；PQX-280A-22HM人工气候箱：宁波莱福科技有限公司；Centrifuge 5418R高速冷冻离心机、移液枪：德国Eppendorf公司；DYY-6C电泳仪：北京六一仪器厂。

1.3方法

1.3.1病害菌的分离纯化

取10 g被污染生产包中不长菌丝的部位（黑斑），置于90 mL无菌生理盐水中，振荡20 min，稀释，取0.2 mL稀释液涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，30℃培养24 h~36 h，挑取单菌落，保存在牛肉膏蛋白胨斜面培养基上备用。

1.3.2病害菌的生理生化鉴定

对经分离纯化得到的菌株进行显微结构、染色观察及相关生理生化鉴定[10-14]。

1.3.3病害菌的分子生物学鉴定

提取菌株的16S rDNA，使用TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit（Code No. RR176），进行PCR扩增目的片段。反应条件具体为：94℃5 min；94℃1min、55℃1min、72℃1.5min，30次循环；72℃5min。反应结束，取5 μL进行3 %琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段。送于上海宝生物公司进行测序，测序结果在GenBank中进行BLAST比对。选取同源性比较高的典型菌株的16S rDNA基因序列作为参比对象，用CLUSTAL 1.83软件进行多序列比对并计算目标菌株与参比菌株之间的序列相似性[15-16]，采用邻位相接法（Neighbor-Joining）[17-18]，应用MEGA4.0软件构建目标菌株与参比菌株之间的系统进化树[18]。

1.3.4人工回染试验

将37℃培养36 h的病害菌制成菌悬液，取5mL接种至杏鲍菇的生产包中，空白对照组接等量的无菌生理盐水；置于培养室和菇房正常培养，定期检测。

2结果与分析

2.1污染杏鲍菇样本的性状

选取工厂中典型的黑斑生产包，具体特征如图1所示。

杏鲍菇生产包菌丝生长不均，有密有疏，密的地方菌丝浓密白净，疏的则菌丝稀少，甚至无菌丝生长，出现大小不一的黑斑。延长培养时间，黑斑出现的地方仍不能长出菌丝。因此，选取黑斑部分作为试验对象。

2.2污染病害菌的分离

选取菌丝生产包中不长菌丝的部分，进行涂布培养。平板培养结果如图2所示。

图1菌丝生产包污染Fig.1 Polluted Pleurotus ergngii package

图2平板培养的菌株Fig.2 The strain cultured on plates

平板上出现一种细菌，命名为130305S。菌落呈直径较小圆形的半透明状，表面有隆起并有光泽度；菌落的中央凸起、湿润，边缘整齐光滑。

2.3病害菌的个体形态特征

通过普通光学显微镜对病害菌的菌体形态进行观察，染色结果如图3、图4所示。

图3 130305S的革兰氏染色结果（×1 000）Fig.3 Gram staining of 130305S（×1 000）

图4 130305S的芽孢染色结果（×1 000）Fig.4 Spore staining of 130305S（×1 000）

130305S为杆菌，以单个排列，革兰氏染色阳性，芽孢染色阳性。芽孢着生在菌体中间，长度约为菌体的1/4。

2.4病害菌的生理生化试验

病害菌的生理生化试验见表1。

表1菌株130305S与芽孢杆菌属部分菌株的生理生化特征Table 1 Physiological properties of strain 130305S and some species of the genus Bacillus

病害菌130305S的生理生化试验结果如表1可知，130305S能够利用葡萄糖产酸，接触酶和淀粉水解反应均为阳性。结合细胞形态、革兰氏染色等结果，参照《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》[12-13]，初步判断病害菌130305S属于芽孢杆菌属（Bacillus）的细菌。参照上述细菌分类鉴定手册对芽孢杆菌属的鉴定手册，进行了其他生理生化试验，并和Bacillus的细菌进行比较。病害菌130305S生理生化试验结果和巨大芽孢杆菌（B. Megaterium）基本一致，结合细胞形态、革兰氏染色等结果，初步判断病害菌130305S是一株巨大芽孢杆菌（B. Megaterium）。

2.5 16S rDNA序列分析

收集病害菌130305S的16S rDNA PCR扩增片段，进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图5所示。

图5菌株130305S的16SrDNA电泳图Fig.5 Electrophoresis patterns of 16S rDNA products from strain 130305S

通过电泳分离后，切胶回收片段进行DNA测序。将菌株130305S的16S rDNA序列与GenBank数据库中的细菌16S rDNA序列进行BLAST同源性比对，结果发现130305S的16S rDNA序列与数据库中Bacillus属细菌的16S rDNA序列自然聚类。利用Clustalx1.83软件进行比对，利用MEGA4.0构建进化树，建树方法采用邻位归并法（Neighbor Joining），结果如图6所示。

图6基于16S rDNA的菌株130305S的系统发育树Fig.6 Phylogenetic tree of strain 130305S based on its 16S rDNA sequences

由图6可见巨大芽孢杆菌130305S和巨大芽孢杆菌菌株（Bacillus megaterium DZ011）的分支，其分支出现的可信度为100 %，表明两者有较高的亲缘性关系。由于16S rDNA的分子结构具有高度的保守性，只在某些位置有少量的核苷酸序列改变，且这些改变具有种属特异性，故而利用16S rDNA构建基因进化树的可靠性很高。从进化时间上来看，130305S在蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus E33L）之后，在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis XF-1、Bacillus subtilis QB928、Bacillus subtilis subsp. Spizizenii）和地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis ATCC14580）之前。

2.6人工回染试验

菌丝生产包培养2 d的结果如图7所示。

图7培养3 d的生产包Fig.7 The mycelium package of trained 3 days

对照组和试验组的菌丝都处于刚生长状态；对照组各包菌丝生长均匀，而试验组的生长差异较大，长势较好的菌丝包与对照组的几乎一样，长势差的则无生长迹象，其中长势差的菌丝包占试验组总包数的2/3。

生产包培养15 d的结果如图8所示。

对照组和试验组的生产包均已长出大片白色菌丝。对照组的菌丝已布满菌丝包的上表面，同时向下延伸至菌包外表面1/3处；菌丝浓密且差异较小。试验组的菌丝则刚长满菌包上表面，开始向下往菌包外表面延伸；长势缓慢的菌丝还没长满菌包上表面，且菌丝稀疏，可看到黑色培养基料。

图8培养15 d的生产包Fig.8 The mycelium package of trained 15 days

生产包培养19 d的结果如图9所示。

图9菌丝培养19 dFig.9 The mycelium package of trained 19 days

对照组的菌丝基本长到菌包底部，长势慢的亦至菌包1/2处；菌丝浓密、洁白，菌丝生长处看不到培养基料。实验组生长最快的生产包，其菌丝长到菌包的1/5处，部分生产包的上表面仍未覆盖满菌丝；菌丝稀疏，出现黑斑。

生产包进入出菇阶段，培养19 d的结果如图10所示。

图10出菇19 d菌包图Fig.10 The mycelium package 19 days during the mushroom period

对照组出菇状况良好，菌袋已长出菌柄和菌盖，长势较好的子实体可以进如采摘环节；试验组的子实体只处于菌柄生长阶段，后续长势无力，究其原因为菌丝生长量不足，无法提供足够的营养供子实体进一步发育生长。

综上所述，试验组出现的症状与分离得到病害菌的初始菌包相同，故判定病害菌130305S的引入可导致菌丝生产包出现黑斑的污染。

3　结论

本试验的研究对象为杏鲍菇生产厂（昆山振兴食用菌有限公司）常见生产包黑斑污染现象的病害菌。通过分离纯化得到病害菌（130305S）；根据菌体形态特征、培养特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析结果以及系统发育学特征，根据多相分类原则，可将病害菌130305S鉴定为巨大芽孢杆菌种（B. megaterium）的菌株。人工回染试验证实病害菌130305S可导致杏鲍菇生产包黑斑出现的污染症状。

分离得到的病害菌为B. megaterium，芽孢杆菌的芽孢对外界有害因子具有很强的抵抗能力和耐受能力。在工厂化生产过程中，生产包灭菌采用集中灭菌方式，由于灭菌量大，可能会导致部分生产包灭菌不彻底，致使芽孢残存下来，造成菌包污染。因此，在集中灭菌时既要保证灭菌的数量，又要保证灭菌的质量；即灭菌时，生产包之间要留有适当的空隙，保证高温蒸汽能够渗透到各个生产包内部，从而有效地杀死芽孢。其次，生产料要搅拌均匀，装料入袋时松紧度合适，避免出现结块。

在保证灭菌质量的前提下，也要对培养室及菇房采取可靠的消毒措施，避免在培养环节染菌；尤其在5、6月份病害高发阶段，这时的气候条件适宜细菌的生长繁殖。因此建议采用物理和化学防治相结合，培养前对培养环境用紫外灯或消毒剂消毒，培养过程控制好湿度，发现污染现象及时处理并结合使用杀菌剂防治[20-21]；而本研究内容将为后续寻求合理可行的防治方案提供参考。

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Analysis of Disease Bacteria on Blackspot of Pleurotus eryngii Package

YAO Lu-ye，SHEN Jin-bo，PEI Dan-dan，SUN Dan-feng，JI Hong
（School of Biology and Food Engineering，Changshu Institute of Technology，Changshu 215500，Jiangsu，China）

Abstract：This study aimed to analysis the disease bacteria which caused blackspot in Pleurotus eryngii package. The strain named 130305S was isolated from the polluted mushroom fungus package from Pleurotus eryngii factory. According to its microstructure，physiological，biochemical properties and 16S rDNA sequences，the phylogenetic position of the strain was defined. The artificial infection experiment which affirmed the correlation between strain 130305S and blacksport was also done. The results showed that 130305S was identified as Bacillus megateriu. The phenomenon of blackspot appearance，that mycelium was no growth in package was caused by strain 130305S.

Key words：Pleurotusergngii；blackspot；disease bacteria；Bacillusmegaterium；artifical infection experiment

收稿日期：2014-08-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.01.046

作者简介：姚璐晔（1983—），女（汉），实验师，硕士研究生，研究方向：食用菌育种及其病害菌。

基金项目：苏州应用基础研究项目（SYN201007；SYN201212）