高效液相色谱法检测酱油中羟脯氨酸的含量研究

□ 李晨辉 周小虎 邵阳学院生物与化学工程系



高效液相色谱法检测酱油中羟脯氨酸的含量研究

□ 李晨辉 周小虎 邵阳学院生物与化学工程系

酱油是人们日常生活中必备的调味品之一，在酱油当中，具有羟脯氨酸的成分，在检测酱油中羟脯氨酸含量的实验中，可应用高效液相色谱法。利用乙醇提取样品，衍生试剂采用2，4-二硝基氟苯，采用360 n m的波长，采用5 μm 4.6 mm×250 mm的色谱柱。通过相应的实验操作，获得酱油当中羟脯氨酸的含量数据。

实验操作

实验材料和实验仪器

在实验当中，采用了羟脯氨酸二甲基甲酰胺、2，4-二硝基氟苯、乙腈、碳酸氢钠、乙酸钠、磷酸二氢钾、冰乙酸、氢氧化钠、盐酸、1%DNFB衍生溶液、羟脯氨酸对照品储备液以及羟脯氨酸对照品工作溶液等实验材料。实验仪器则主要包括离心机、工作站、柱温箱、自动进样器、紫外检测器以及高效液相色谱仪等。实验样品的来源主要是自制酸水解蛋白液、自购样品等。

实验方法和实验步骤

在实验当中，首先在1 mL样品中加入3 m L乙醇，混合离心之后，在10 mL棕色容量瓶中放置0.25 mL上清液，将1.0 mL碳酸氢钠、0.75 mL水加入其中，并加入1 mL DNFB，均匀混合后进行30 min、60℃的衍生。冷却到室温，再加入磷酸二氢钾溶液，摇匀过滤，最后进行进样分析。实验中采用5 μm 4.6 mm×250 mm色谱柱，流动相分别为乙腈-水、乙酸钠，柱温为30℃、流速为每分钟1.0 m L，检测波长为360 mm，进样量为10 μL。

结果分析

检测条件

在选择检测条件的过程中，首先对样品进行前处理，对于样品不进行水解，而是直接进行提取，选择乙醇作为提取溶剂，消除样品中色素的干扰。在选择衍生试剂的过程中，根据实际要求，采用了DNFB试剂，因为其具有稳定性好、重现性好、成本低、时间短的优势。最后选择流动相的梯度，对羟脯氨酸采用配比不同的流动相进行洗脱操作，观察干扰峰、目标峰、色谱峰等情况。基于此，得出5.1 min的羟脯氨酸保留时间。

线性范围和检出限

对羟脯氨酸对照品工作溶液进行前处理之后进行上机测定，根据标准品峰面积对浓度，得出线性回归方程，y = 321.04x + 767.74。在10～320 mg/L羟脯氨酸比浓度下，峰面积、质量浓度之间的线性关系较为良好。采用3倍信噪比，对羟脯氨酸进行计算，得到了2.5 mg/L的检出限。

方法回收率和精密度实验

在不含有羟脯氨酸成分的酱油样品中，分别加入10、40、160 mg/L的羟脯氨酸对照品，进行相应的前处理之后，对回收实验进行操作。针对各个试样，分别进行6次平行处理，在不同的添加水平当中，得到的平均回收率分别为110.18%、97.79%、101.15%。因此总的来看，此种方法能够得到97.19%～110.18%的回收率，能够控制在3%以下的相对标准偏差。

样品测定

在动物水解蛋白液当中，羟脯氨酸的含量分别为猪瘦肉水解溶液中92.32 mg/L，猪皮水解液中3 850.45 mg/L，普遍具有较高的羟脯氨酸含量。经过计算，在猪瘦肉水解液、猪皮水解液当中，相对羟脯氨酸含量分别为37.03 mg/g和855.55 mg/g。在纯酿造酱油当中，羟脯氨酸的含量通常为0.67～1.93 mg/g。在自制水解植物蛋白液当中，在豆粕、麸皮、小麦水解液当中，都检测出了羟脯氨酸，含量约为9.51～20.11 mg/g。

由此可见，在动植物水解蛋白液当中，都含有羟脯氨酸，但植物水解蛋白液中的含量要明显低于动物水解蛋白液。所以，通过对酱油样品中羟脯氨酸含量的测定，就能够判断其中是否添加了酸水解动植物蛋白液。对购买的酸水解植物蛋白液样品进行检测，其中羟脯氨酸的含量为2.90～16.00 mg/g，要比纯酿造酱油含量高。对在市场中购买的酱油样品进行检测，发现其中的羟脯氨酸含量为0.81～7.88 mg/g，同时，有四种酱油样品中的羟脯氨酸含量要明显比纯酿造酱油高，因此，其中可能掺入了水解蛋白液。

结论

在人们的日常生活当中，酱油是一种必不可少的重要调味品。在众多酱油品类当中，纯酿造酱油是最为健康的，但同时成本也是比较高的。因此，很多商家将水解蛋白液添加在酱油当中，冒充纯酿造酱油进行销售。对此，可以采用高效液相色谱法对酱油当中的羟脯氨酸含量进行检测，根据测得结果判断酱油当中是否掺入了水解蛋白液。

作者简介：李晨辉（1992-）男，云南曲靖人，本科。研究方向：食品科学。周小虎（1989-）男，湖南邵阳人，硕士研究生，助教。研究方向：食品科学。