卢立康唑醇质体体外抗真菌活性研究

樊建峰 林碧雯 李恒进(解放军总医院皮肤科,北京100853)



卢立康唑醇质体体外抗真菌活性研究

樊建峰 林碧雯 李恒进
(解放军总医院皮肤科,北京100853)

【摘要】目的 检测卢立康唑醇质体体外抗菌活性。方法 采用微量液基稀释法检测卢立康唑醇质体、脂质体、45%水醇溶液对皮肤癣菌、念珠菌的体外抗菌活性。结果 卢立康唑醇质体对皮肤癣菌及念珠菌的MIC值低于脂质体及水醇溶液,且对毛癣菌属较念珠菌属的MIC值更低。结论 卢立康唑醇质体的体外抗菌性能优于脂质体及水醇溶液。

【关键词】卢立康唑醇质体;皮肤癣菌;念珠菌;药物敏感性

[Chin J Mycol,2016,11(1):13-15]

卢立康唑醇质体具有较好的渗透性及透皮率,为检测卢立康唑醇质体、脂质体及醇溶液的体外抗真菌活性,本试验采用美国临床实验室标准化协会(CLSI)[1-2]所推荐的微量液基稀释法来测定上述制剂的MIC值,用目测法观察结果。

1 材料与方法

1.1 实验菌株

红色毛癣菌临床株(5株)、须癣毛癣菌临床株(5株)、近平滑念珠菌标准株ATCC22019、白念珠菌标准株ATCC90028、白念珠菌临床株(4 株)、近平滑念珠菌临床株(4株)、克柔念珠菌临床株(5株)、光滑念珠菌临床株(5株),均来自本院微生物科。

1.2 实验仪器与试剂

U型底96孔细胞培养板(浙江拱东医用塑料厂)、麦氏比浊管(法国梅里埃公司)、隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)、超净工作台(苏锦集团安泰公司)、分析天平(上海民桥医疗器械有限公司)。

沙氏培养基(SDA)、马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA本院微生物科),氟康唑(上海三维制药)、卢立康唑醇质体、脂质体、45%乙醇水溶液(试验中自制)。

1.3 实验方法

药物浓度配制 ①用无菌注射用水稀释卢立康唑的各种剂型(卢立康唑醇质体、卢立康唑脂质体、45%卢立康唑乙醇水溶液),使其终质量浓度为1 600μg/m L,置于-20℃冰箱中备用。②取1 600 μg/m L药液用RMPI-1640培养基50倍稀释,配第1管浓度为32μg/m L。

皮肤癣菌菌悬液配制 ①取1 m L无菌的0. 85%盐水加入无菌试管中,挑取一定量的菌落,用巴氏吸管轻轻抽吸,制成菌悬液。②将菌悬液吸至无菌试管中,静置3～5 min后,取上部匀质液体(含孢子或菌丝片段),在振荡器上震荡15 s。③用无菌0.85%盐水调节菌悬液浓度,使其麦氏浊度值调整至0.5,将此菌悬液用RPMI-1640稀释50倍得出2倍所需终浓度(0.4×104～5×104CFU/ m L)的菌悬液。

念珠菌菌悬液配制 用RPMI-1640稀释2 000倍得出终浓度(0.5×103～2.5×103CFU/ m L)的菌悬液。

接种和培养 在96孔板的每孔加入100μL的菌悬液,每次实验均包括标准株ATCC90028和ATCC6258。念珠菌药敏板于35℃培养,皮肤癣菌药敏板于28℃培养。

质控设置 采用ATCC22019为念珠菌质控菌株,ATCC90028为皮肤癣菌质控菌株,每次实验同时做其氟康唑抑菌药敏。只有当氟康唑对ATCC22019的MIC介于1～4μg/m L,对ATCC90028的MIC≤0.125～0.5μg/m L方认为实验准确可靠。

MIC值判定及结果 MIC值为肉眼直接观察到的真菌生长完全被抑制时的抗真菌药物浓度,由于唑类药物终点不易判定,皮肤癣菌7 d读结果, 以50%生长抑制为MIC终点浓度。念珠菌2 d读结果,以80%生长抑制为MIC终点浓度。

目测观察各实验孔的菌生长量 ①清晰(100%被抑制生长)。②略模糊(80%被抑制生长)。③浊度显著减低(50%被抑制生长)。④浊度轻度减低(20%被抑制生长)。⑤浊度未减低(0%被抑制生长)。

2 结 果

卢立康唑醇质体及其对照制剂的MIC结果见图1、表1。

卢立康唑醇质体与脂质体对上述各菌的MIC值低于卢立康唑水醇溶液(P＜0.01),卢立康唑醇质体与脂质体对上述各菌MIC值比较均无统计学意义,考虑与样本量低有关。参照图1卢立康唑不同剂型对念珠菌菌株MIC值:醇质体＜脂质体＜水醇溶液;卢立康唑不同剂型对红色毛癣菌及须癣毛癣菌菌株MIC值:醇质体/脂质体＜水醇溶液。另外,卢立康唑对毛癣菌属较念珠菌属相比MIC值低,更敏感。

3 讨 论

卢立康唑是新型抗真菌药物,有抗菌活性强、起效快等优点,且中国市场并未使用,目前也无醇质体制剂。因此我们选取其为主药,进行醇质体抗菌性研究。目的在于加强主药的抗菌能力,使其发挥更大的抗菌作用。卢立康唑脂质体体外实验中, Koga等[3]用肉汤微量稀释法比较了卢立康唑与其他9种药物(特比萘芬、利拉萘酯、布替萘芬、阿莫罗芬、酮康唑、克霉唑、奈康唑、咪康唑和联苯苄唑)的抗菌活性,显示卢立康唑对毛癣菌属有较强的抗菌活性。

图1 卢立康唑不同剂型最低抑菌浓度Fig.1 The MICs of luliconazole ethosome,liposome and hydroalcoholic solution

真菌感染一般分为浅部真菌感染和深部真菌感染。在我国,毛癣菌属中的红色毛癣菌、须癣毛癣菌、紫色毛癣菌是体股癣、手足癣的常见致病菌[4-5]。因此本实验主要选取白念珠菌、红色毛癣菌、须癣毛癣菌等作为研究菌株,检测卢立康唑醇质体及各种对照剂型MIC值,初步评价其体外抗真菌活性。

由于皮肤角质层屏障的存在,一般经皮外用药难以携带大量药物进入皮肤深层,达到理想的抗菌效果。刘利萍等[6]制备的克霉唑醇质体,体外抗菌活性实验结果显示,对白念珠菌的最低抑菌浓度值是克霉唑脂质体的50%,是游离克霉唑乙醇水溶液的12.5%,最低杀菌浓度的变化趋势与最低抑菌浓度类似,醇质体组杀菌所需克霉唑剂量明显低于脂质体组。另外,在杀菌起效方面,克霉唑醇质体明显优于脂质体和乙醇水溶液。最低抑菌浓度、最低杀菌浓度和抗菌-时效实验结果从另一方面也证明了醇质体比脂质体具有更快的透过速率、更高的渗透能力和更短的时滞,从而使药物能够更快和更好的发挥抗菌作用,有助于深层真菌感染的治疗。盐酸阿莫罗芬醇质体经共聚焦激光扫描显微镜实验表明,醇质体与脂质体及乙醇溶液相比,可更有效增加药物的透皮量和穿透深度,增加药物在皮肤中的滞留量[7]。

表1 卢立康唑不同剂型最低抑菌浓度Tab.1 The MICs of luliconazole ethosome,liposome and hydroalcoholic solution

本试验中卢立康唑醇质体对七种菌株的MIC值均低于卢立康唑其他对比剂型(脂质体、水醇溶液),考虑可能与醇质体穿透机制中细胞内传递有关。它可携带药物直接透过细胞膜将药物释放到细胞内发挥作用。卢立康唑软膏不能溶于水,无法均匀分散在水中,因此未选取其作为对照。对白念珠菌及其他四种念珠菌的MIC值均低于脂质体及水醇溶液,对红色毛癣菌及须癣毛癣菌的MIC值也低于水醇溶液。与其他研究中克霉唑和阿莫罗芬的醇质体制剂的体外抗真菌活性较脂质体和水醇溶液强是一致的。但因选取菌株较少,样本量低,造成抑菌浓度范围接近,且无统计学差异,所以在下一步卢立康唑醇质体对豚鼠真菌模型上的疗效观察之前,应收集大量菌株,重复体外抑菌实验。同时我们发现卢立康唑对红色毛癣菌、须癣毛癣菌较念珠菌敏感程度高,这与国外文献报道一致。

参考文献

[1]Clinical and Laboratory Standards Institute/National Committee for Clinical Laboratory Standards.M27-A3.Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeast.Approved Standard,3rd ed[S].Wayne,PA:Clinical and Laboratory Standards Institute,2009.

[2]Clinical and Laboratory Standards Institute/National Committee for Clinical Laboratory Standards.M38-A2.Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeast.Approved Standard,3rd ed[S].Wayne,PA:Clinical and Laboratory Standards Institute,2008.

[3]Koga H,Nanjob Y,Makimura K,et al.In vitro antifungal activities of luliconazole,a new topical imidazole[J].Med Mycol,2009,47(6):640-647.

[4]吴颖,万哲,李若瑜.联苯苄唑对浅部真菌病致病真菌的体外抗菌活性研究[J].中国药物与临床,2008,8(5),419-420.

[5]帕丽达·阿布利孜.皮肤癣菌与皮肤癣菌病[J].皮肤性病诊疗学杂志,2010,17(1):83-84.

[6]刘利萍,毛威,安原初.克霉唑醇质体和脂质体的体外经皮渗透性及抗菌性的对比研究[J].中国药学杂志,2009,44(4): 278-282.

[7]王慧,魏玉辉,刘文静,等.盐酸阿莫罗芬乙醇脂质体的制备及评价[J].中国新药杂志,2010,19(13):1175-1179.

[本文编辑]施 慧

·论著·

The antifungal susceptibility test in vitro of luliconazole ethosomes

FAN Jian-feng,Lin Bi-wei,Li Heng-jin
(PLA General Hospital Department of Dermatology,Beijing 100853,China)

【Abstract】Objective To study antifungal susceptibility of luliconazole ethosomes in vitro.Methods In vitro,antifungal activity of luliconazole ethosome,liposome,hydroalcoholic solution:MICs were determined using the micro-broth dilution assay.Results The MIC of the luliconazole ethosome was lower than that of liposome form or hydroalcoholic solution form.The MIC of luliconazole ethosome to Trichophyton spp.was lower than the sensitive degree to Candida spp.Conclusions In vitro,the antifungal effect of luliconazole ethosome is better than luliconazole liposome or its hydroalcoholic solution.

【Key words】luliconazole ethosomes;dermatophytes;Candida;antifungal succeptibility

[收稿日期]2014-12-10

通讯作者:李恒进,E-mail:lhengjin@163.com

作者简介:樊建峰,男(汉族),硕士,副主任医师.E-mail:fanjianfeng1@tom.com

【中图分类号】R 978.5

【文献标识码】A

【文章编号】1673-3827(2016)11-0013-03