种子超干贮藏的生理生化基础和耐干机制研究进展

(贵州省林业调查规划院， 贵阳 550003)

种子超干贮藏的生理生化基础和耐干机制研究进展

冯陆春
(贵州省林业调查规划院， 贵阳 550003)

近年来,种子超干贮藏逐渐成为种子生物学及植物种质资源保存领域的研究热点，本文从超干贮藏种子的生理生化基础、耐干机制等方面综述了种子超干贮藏国内外研究的最新进展，并对此领域的研究进行展望。

种子； 超干贮藏； 生理生化基础； 耐干机制

种子贮藏对林业健康可持续发展以及物种多样性和遗传多样性保护都具有重要的意义。多年来，种子贮藏法主要是低温和超低温的保存方法，但这种贮藏的方法需要投入大量资金建设冷库，技术要求较高，并且消耗大量能源，使用范围较为局限，因此，迫切需要寻找一种投资小，能耗低，贮藏效果相似的新贮藏方法。在此背景下，种子超干贮藏研究热潮由此展开。种子超干贮藏，也叫超低含水量贮藏，是指将种子含水量降至5%以下，密封后在室温条件下贮藏，通过降低种子的含水量便可获得与高含水量种子在低温条件贮藏相同的效果。超干贮藏的研究始于20世纪80年代末，国内相对于国外来说起步较晚。程红焱等[1]1989年首先在我国开展种子超干贮藏研究,此后,许多科学工作者做了大量工作，并取得了一系列重要进展。本文就近30年来，在探索超干贮藏过程中生理生化基础和耐干机制的研究取得的进展进行了回顾。

1 超干贮藏的生理生化基础

1.1 超干贮藏种子的细胞结构的变化

细胞结构完整是保持种子活力的基础，在种子贮藏过程中，细胞膜的损伤、细胞器的畸变及解体将导致种子活力的下降，首先表现在胚根尖分生组织的超微结构变化上。经过超干处理的种子，在细胞结构上与经老化的未超干种子有较大区别。程红焱等[2]的研究表明：超干处理后几种芸苔属植物种子的脱氢酶、超氧化物歧化酶、过氧化物酶等酶系统保持完好，细胞膜系统完整性良好，细胞超微结构及功能也保持完好。张明方等[3]用透射电镜观察洋葱种子胚根尖细胞的超微结构,发现经处理的超干种子，细胞核和内质网正常且丰富,核膜界限清晰,脂质球沿细胞壁呈环状排列,无中空的电子致密物质(脂肪消耗后的残留物)。而未超干处理的对照种子，细胞核膜界限不清晰,部分细胞核呈解体状，有胞饮现象,线粒体变形,脂质体融合成团并且呈不规则排列,出现电子致密物质。汪晓峰等[4]研究发现，经超干处理的种子，细胞膜的结构和功能稳定，胞内的超微结构保持完整，从而防止了贮藏物质的外渗。这些研究从细胞学的角度阐释了超干种子耐藏性增强的原因。

1.2 超干处理对种子生物膜系统的影响

代谢复合物的正确组合及代谢组分的空间分隔是调控细胞代谢非常重要的因子,而膜系统对于细胞的区域分隔具有极其重要的作用,一旦细胞膜系统遭到破坏将引起代谢异常、加速种子生活力的丧失[5]。

膜的选择透性是细胞膜结构稳定的首要表现，细胞内大量的电解质外渗是细胞膜受损害的一个主要标志[1]。电导率的高低可表示电解质的外渗程度和种子贮藏过程中膜系统的完整性[6]。前人的研究表明：榆树[7]、矮沙冬青[8]、华山松[9]、大叶白麻[10]等超干种子经过一定时间贮藏后,电导率较低，回湿吸胀时细胞内电解质的外渗量显著低于未经超干处理的种子,这表明在贮藏过程中，超干种子细胞膜保持了较完善的选择透性。

膜的流动性反映了细胞膜的物理状态,细胞膜处于流动相是细胞进行生命活动的必要条件。尽管超干处理对一些种子细胞膜体系的构型有一定的影响，但通过PEG渗透调节可以修复，从而使膜系统的功能保持完善。汪晓峰等[4]应用荧光探针研究榆树种子超干处理对膜流动性的影响,结果表明,种子经超干处理后,在人工老化和自然老化条件下，与低温贮藏的种子比较，超干贮藏种子的细胞膜的微粘度无显著变化,过干贮藏种子的细胞膜的微粘度虽然有所偏高，但也低于高含水量室温贮藏的种子，这些结果与超干种子能保持较高活力水平完全一致,可能是超干贮藏较好地维持了膜蛋白的完整性及磷脂双分子层中碳氢链分子的流动性[1]，表明适度超干能有效保护种子的膜结构和功能的完整性。

1.3 超干处理对脂质过氧化与抗氧化酶系统的影响

种子劣变过程中，脂质过氧化作用产生了许多潜在的毒物，如自由基及丙二醛(MDA)等。自由基能够破坏生物大分子聚合物及细胞的膜系统，从而引起一系列复杂的连锁反应，最终导致种子劣变[11]，方莹[12]研究表明：光皮桦种子经超干处理后氧自由基清除能力高于未超干处理的种子。超干处理的红花种子活力显著高于未超干种子，其细胞内自由基的产生速度和数量均低于未超干种子[13]。尽管种子在超干状态下增加了自由基与作用区域的接触机会，但SOD、POD、CAT等自由基清除系统的活性则显著高于未超干种子，抑制了脂质过氧化作用[14]。

丙二醛是种子在贮藏过程中逐渐累积的有毒的脂质过氧化产物之一，其含量常可以反映种子劣变程度[15]。超干种子释放的丙二醛释含量低于未超干种子，这是超干种子耐藏性得到提高的一种反映。林坚等[16]进行了杜仲种子超干贮藏的研究，结果表明其种子含水量降至3.5%以下时超干种子比对照种子脂质过氧化产物丙二醛的积累减少，耐藏力增强。陈志宏等的研究发现塔落岩黄芪超干种子丙二醛含量低于未超干处理种子，表明超干处理降低了种子脂质过氧化作用[17]。邹冬梅[18]研究表明，银合欢种子超干贮藏后，其丙二醛含量比原始种子增大不明显，说明超干贮藏一定程度上抑制了丙二醛的产生和积累，从而抑制了种子脂质过氧化作用的发生，有利于种子活力的保持。

抗氧化系统(酶促或非酶促保护系统)是植物体内的一套清除活性氧系统，具有保持活性氧代谢平衡、维持细胞膜的结构和功能的作用。酶促保护系统主要是指超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、愈创木酚过氧化物酶(GPX)、谷胱甘肽还原酶(GR)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)等；非酶促保护系统主要包括抗坏血酸(AsA)、a-生育酚(VE)、还原型谷胱甘肽(GSH)、3-胡萝卜素、抗氧化剂维生素C(Vc)等，还包括多酚、单宁、黄酮类物质等次生代谢物质和一些渗透调节物质，如脯氨酸、甜菜碱、甘露醇等。这些系统通过多种途径直接或间接地猝灭活性氧，阻止或减缓脂质过氧化作用，保持种子活力[19-21]。抗氧化酶可以有效地清除导致种子活力降低的自由基和过氧化氢[22]，如SOD可以将超氧化物转化为过氧化氢，过氧化氢被CAT转化成水和氧气，从而被清除。系列的研究[23-25]表明，经过一段时间贮藏的超干种子在回湿吸胀萌发后，酶活性仍然保持较高的水平,与低温贮藏种子相似，并无明显的差异,而未超干种子的脱氢酶活性则大部分丧失。超干处理对种子的抗氧化酶活性有明显影响，经过超干处理的坡柳种子[26]、山合欢种子[27]的CAT，POD和SOD活性与未经超干的种子相比有显著提高，说明超干种子内抗氧化系统未受破坏,一旦种子吸水萌动,就协同抗氧化剂共同清除由贮藏期间劣变积累的自由基、脂质过氧化等毒害物质,从而保证超干种子具有较高活力水平。

1.4 超干处理对遗传稳定性的影响

贮藏种子不仅要保持种子高的生活力和发芽能力，还需要保持其遗传稳定性，所以贮藏种子的遗传稳定性检测是评价种子贮藏效果的一个重要方面[21]。通常种子劣变会导致染色体异常，而超干贮藏能降低染色体畸变率。程红炎[28]的研究结果显示超干贮藏后染色体功能正常，DNA没有明显变化，表明超干处理能有效抑制榆树种子根尖细胞染色体畸变，推迟变异的时间。李毅[24]探讨了甘肃河西地区3种荒漠植物种子遗传稳定性，结果表明,超干贮藏不会引起种子的遗传变异。Jing和Tao研究榆树超干种子，发现超干处理能有效抑制其伴随时间推移而产生的生活力下降和染色体变异，明显延长种子寿命[29]。林坚[16]对超干贮藏后杜仲种子的过氧化物同工酶谱进行了分析，刘艳萍等[8]采用分子标记的方法对超干处理后的矮沙冬青种子进行遗传稳定性检测，结果均表明：超干处理前后种子未发生遗传变异。可见，超干贮存有利于保持种子的遗传稳定性。

1.5 超干处理对种子内水分状态的影响

种子内水分的存在状态对水分的保持非常重要。细胞中水分呈现的状态与其作用密切相关,由于亲水和疏水的相互作用,水分可以影响膜脂、核酸及蛋白质等大分子物质的结构，其物理状态决定了种子内生化反应能否发生。种子在超干处理后能否保持较高生活力以及发芽率取决于种子尤其是种胚细胞对束缚水的保持能力[1]，曾广文等[13]对红花种子超干期间自由基和水分状态的研究发现，自由水，束缚水的比例随含水量下降而降低，在超干状态下种子中仍然保持着大部分束缚水，这就为超干种子保持较高活力提供了有利的内部环境条件。通过干燥，降低种子的含水量能提高种子的贮藏稳定性，但并不是含水量越低越好[30]，过度干燥不仅不能延长种子贮藏寿命，甚至会加速种子劣变[31-33]。保持生物大分子的结构必需存留一定水分子,另外，水分子能淬灭自由基,极度失水后，自由基的活动增强[34]，因此，超干贮藏需要一个最适含水量。

大量研究表明，超干种子的最低含水量和最适含水量随植物不同而不同，如红麻种子超干贮藏水分临界值为4%左右[35]。含水量为4.18%的落叶松超干种子发芽率、发芽指数以及活力指数均高于其他含水量[36]。5%是柳杉种子超干贮藏的临界含水量,低于此界限,其发芽率、发芽势、活力指数、发芽指数值均大幅下降，种子出现干燥损伤[37]。黄檀种子的耐干燥临界含水量在3.1%以下[38]。宋红等[39]研究认为:含水量3%以上的红松超干种子,经回水处理后，种子生活力不受影响,含水量3%以下生活力与对照比明显下降,临界值为3%,超干处理种子的最适含水量是4%。学者普遍认为,油料种子临界含水量的下限比淀粉和蛋白质类种子低,含淀粉较多的种子比含蛋白质较多的种子耐干燥[15，40]。程红焱等[41]对淀粉类、油料类、蛋白质类、耐干品种以及对水分敏感的品种等不同类型的种子进行水分热力学分析表明：保持束缚水的能力，榆树和大豆种子低于油菜、芝麻、和花生种子。相等条件下的种子最适含水量越低，疏水物质含量越高，种子耐干性越强[21]。对于不同种子超干贮藏的最适含水量和最低安全含水量目前还没有一个简单易行的通用方法来准确测定[42-43]，需要进一步深入研究，从而避免种子过度干燥，活力受损。

2 超干贮藏的耐干机理

2.1 蛋白质与种子耐干性的关系

Vertucci等提出，种子耐干性表现为一种数量性状，与种子内碳水化合物、蛋白质、脂肪的含量呈正相关关系[44]。同时，还与种子内部合成新物质有关。Blackman等发现许多种子在贮藏物质积累后期会合成一类特殊的富集蛋白(LEA)[45]，LEA的结构中存在显著高含量的极性残基,能不同程度的螯合离子和替换水的氢键,将细胞内的生物大分子通过内聚水层包被起来，阻止大分子的凝结，保护细胞结构的完整性，保持膜系统的稳定性，提高回水修复能力，减少种子因干燥而造成的细胞损伤[46]。目前，已经有LEA与种子耐干性相关的报道，如玉米[47]，花生[48]等。但关于LEA和植物耐干机理的关系，并没有全面深入的阐明。有研究认为，LEA与非还原糖形成一种复合物，协同控制干燥时的失水速度，从而保护种子[49]，在种子细胞脱水时起重要作用。也有报道指出，LEA可能与种子耐干性的获得无关[50]。如英国栎种子在有水环境或温度胁迫时同样检测到了LEA转录，LEA的合成与种子耐干过程也不完全一致[51]，因此，对于种子的耐干性，LEA虽然可能是一个必要的组成部分但还不能提供充分的保护作用[21]。

2.2 可溶性糖与种子耐干性的关系

可溶性糖在种子脱水过程中的作用越来越受到人们的关注[52]，汪晓峰等采用渗控水势PEG溶液,分别添加葡萄糖和蔗糖进行比较,结果表明蔗糖具有保护膜结构、保持膜流动性的作用。这意味着糖类在种子耐干性中起着一定程度上的保护作用[7]。其作用策略之一就是通过可溶性糖类与膜表面相互协作实现对膜Tm的动态调控。另一保护模式是:可溶性糖和其它物质如LEA蛋白等一起参与低含水量下胞质的玻璃化转变和提高玻璃化状态的稳定性。而玻璃态的形成被认为是植物系统抵御脱水伤害、提高贮藏稳定性的一个有效策略[53]。总之，累积的可溶性糖，保持了细胞膜在干燥状态下的结构和功能，增强了其稳定性，免受脱水伤害，提高了清除自由基的能力,从而使种子能够抵御脱水造成伤害,保持高活力，提高耐藏性[4，54-56]。Holmstrom等学者将编码海藻糖合成酶的基因导入到烟草中,烟草内海藻糖的含量明显高于对照,在相同条件下进行干燥处理，经复水后,对照幼苗严重损伤死亡,而转基因幼苗则逐渐恢复并开始生长，为糖与种子耐干性有关提供了直接的证据[57]。

此外，耐干性的形成也与植物种类和发育时期密切相关。综上所述,种子的耐干性不仅仅是某种单一因子的作用,而是多因子综合调控的复杂过程。

3 展 望

超干贮藏技术对种质资源的保存具有巨大的应用前景，目前，也取得了一定的研究成果，但涉及到林木种子的研究并不广泛。并且出现了部分有争议和一系列待深入研究的问题，如种子超干贮存的最适含水量和最低含水量的确定，超干贮存的生理生化机制以及遗传稳定性分子机制还没有全面的认识，耐脱水植物对两亲分子分配行为的控制机理也不清楚等,要使超干贮藏技术在林木种子的贮藏上得到广泛应用，不仅需要从理论上研究超干贮藏的机理特性，还需要扩大研究材料的范围。如果在此基础上，进一步阐明种子耐干机理，不断完善种子超干技术，便可为林业优质种子的生产和流通的质量保障提供一条新途径。

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Research Progress on Basis of Physiology and Biochemistry and Resistance Mechanism of Seed Under Ultra-dry Storage

FENGLuchun

2016-01-13

冯陆春(1970—)，女，广西博白人；本科，农学学士，高级工程师，主要从事森林资源调查、规划、设计、监测、评估等工作；E-mail：780448247@qq.com。

李 超(1985—)，男，广东台山人；本科，工程师，主要从事森林资源调查、规划、设计等工作；E-mail：264140378@qq.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2016.08.055

S 339.3+3

A

1001-4705(2016)08-0055-05