乳铁蛋白调控炎症反应中NF-κB表达的分子机制研究进展

陈柳菁，李娟，孟姝

(四川大学华西口腔医学院，成都610041)

乳铁蛋白调控炎症反应中NF-κB表达的分子机制研究进展

陈柳菁，李娟，孟姝

(四川大学华西口腔医学院，成都610041)

乳铁蛋白是一种天然的免疫调节蛋白，而NF-κB在细胞增殖、分化、免疫调节和炎症反应等过程中具有重要作用。乳铁蛋白与NF-κB在结构与功能上密切相关，其在炎症反应中对NF-κB具有重要的调控作用；在机体的不同疾病状态和炎症反应的不同阶段，不同物种的乳铁蛋白呈现出不同的效应。

乳铁蛋白；核转录因子kappa B；炎症

乳铁蛋白是在多个种族之间具有高度同源性的多功能糖基化蛋白[1]，具有抗微生物、激活免疫细胞、抑制炎性因子、抑制嗜酸性粒细胞增殖、清除自由基、抑制癌细胞生长等功能[2, 3]。NF-κB是一种重要的快反应核转录因子[4]，在炎症反应中发挥重要作用；NF-κB信号通路又是与炎症级联反应关系最为密切的信号通路，以NF-κB为节点，多条信号通路相互沟通交联。基因层面上，乳铁蛋白DNA上具有两个位点，可能通过与NF-κB基因二聚转录因子REL同源区(RHDs)靶点结合而实施对NF-κB的调控[5, 6]；分子层面上，乳铁蛋白的碳水化合物链[7]和N端肽段[8]是调控NF-κB表达的重要结构。乳铁蛋白对炎症反应的干预与其对NF-κB的调控作用密不可分。本研究对炎症反应中乳铁蛋白调控NF-κB表达的分子机制研究进展综述如下。

1 乳铁蛋白在结构和功能上与NF-κB的联系

1.1 乳铁蛋白调控NF-κB有关的基因位点 当G-菌侵入机体时，乳铁蛋白通过与G-菌的脂多糖(LPS)相互作用调控NF-κB的表达。Pauciullo等[6]发现，山羊乳铁蛋白启动子区包含了3个可能与LPS结合相关的元件，其中2个是与调控NF-κB表达有关的位点，即-960/-949和-852/-838。这两个位点所属区域在人、牛、猪、鼠、骆驼等物种中均具有高度保守性，说明其在乳铁蛋白对NF-κB基因层面的调节中起到了关键作用。Gilmore等[5]则认为，乳铁蛋白基因启动子和增强子区的κB位点(50-GGGRNNYYCC-30，N为任意核苷酸)能与NF-κB基因二聚转录因子REL同源区(RHDs)结合，从而实施对NF-κB的调控。

1.2 乳铁蛋白调控NF-κB相关的结构 乳铁蛋白是一种糖蛋白，糖基共价结合在Asn-XThr/Ser(X为任意氨基酸)的天冬酰胺残基上，形成2～4条N-连接型碳水化合物链。该碳水化合物链经分离、纯化后可促进鼠成纤维细胞NF-κB RelA:p50的活化；同时，在THP-1细胞系的实验中也表明，当人乳铁蛋白的碳水化合物链被水解成寡肽甚至氨基酸时是无法诱导NF-κB活化的[9]。上述研究表明，碳水化合物链在人乳铁蛋白诱导NF-κB活化方面不可或缺[7]。乳铁蛋白多肽链N端肽段也为乳铁蛋白功能的发挥提供了基础。Ando等[7]研究发现，乳铁蛋白可以削弱THP-1细胞株中LPS诱导NF-κB活化的能力，与乳铁蛋白上能与LPS结合的某一多肽段相关。Xin等[8]研究发现，猪乳铁蛋白N端肽段LFP-20能抑制IKK-β的磷酸化，使IκB-α和NF-κB(p65)的磷酸化减少，从而抑制NF-κB(p65)的活化。

2 乳铁蛋白对炎症反应中NF-κB表达的调控作用

静息状态下，NF-κB与抑制单位IκB的中心区结合，以NF-κB-IκB复合体的无活性形式存在于细胞质中。尽管许多因素都能活化NF-κB，但所有通路都拥有一个核心调控子，即IKK复合物。IKK复合物由2个催化亚单位(IKKα、IKKβ)及1个调控亚单位IKKγ(NF-κB的基本调节子，也称为NEMO)组成[10]，IKKβ的活化能使IκBα磷酸化，随后被K48(或K63)多聚泛素化和蛋白酶降解，使NF-κB脱离IκB的束缚而进入细胞核中，与DNA结合，启动下游靶基因的表达，发挥免疫调节作用[11]。也有报道显示，NF-κB的活化依赖于自身第536位氨基酸Ser536的磷酸化，与IκBα无关[12]。乳铁蛋白既参与固有免疫，又参与适应性免疫，不仅可帮助宿主抵抗微生物入侵，也使宿主免于遭受炎症的破坏性效应。但是在机体不同的疾病状态和炎症反应的不同阶段，不同物种的乳铁蛋白表现出不同的效应，即乳铁蛋白既有抗炎作用，又有促炎作用。乳铁蛋白对NF-κB的调控大多数情况下表现为抑制，但也可表现为促进。

2.1 下调NF-κB表达 研究表明，在2.5%硫酸葡聚糖钠(DSS)诱导的小鼠肠炎模型中，牛乳铁蛋白能减少NF-κB的表达，缓解小鼠炎症表现[13]。van der Does等[14]研究表明，hLF1-11(由人乳铁蛋白N端头11个氨基酸组成)能降低单核细胞中NF-κB(p65)的表达。此外，乳铁蛋白能减少2型糖尿病小鼠模型中LPS诱导的TNF-α、IL-6和IL-1表达[15]，其机制与竞争性结合相关细胞因子启动子区 NF-κB位点有关[16]。研究表明，在人K562和Caco-2细胞核中的ICAM-1启动子区域，LF作用位点和NF-κB作用位点存在一定交叉[17]。外源性乳铁蛋白(LF)可以转移到细胞核内，竞争性结合ICAM-1启动子上与NF-κB位点重叠的LF位点，从而抑制TNF-α诱导的内皮细胞ICAM-1等炎性因子的生成[18]。乳铁蛋白下调NF-κB的作用主要通过MyD88途径和TRAF6途径实现。

2.1.1 MyD88途径 生理情况下，TLR4被激活后，MyD88可在桥接配体TIRAP的介导下与TLR4结合；也能借助双方蛋白结构中的死亡域、激酶与IRAK4结合。IRAK4相关受体随后使IRAK1磷酸化，磷酸化的IRAK1则能与E3泛素化连接酶TRAF6形成复合物[19]，在包含UBC13和UEV1A的E2复合物的辅助下，引起由K63介导的TRAF6多聚泛素化，并通过TAB2和TAB3泛素结合蛋白招募TAK1[20]。TAK1是一种IKK激酶，能磷酸化IKKβ活化链中关键性的丝氨酸，从而使IKKβ活化，随后磷酸化，并经历IκBα K48基团多聚泛素化的过程，最终导致IκBα降解，激活NF-κB[21]。Xin等[8]研究表明，LPS能上调猪肺泡巨噬细胞MyD88表达，而猪乳铁蛋白活性肽段(LFP-20)则抑制MyD88表达。采用siRNA技术干扰巨噬细胞中MyD88的表达后，LFP-20则无法抑制IKK-β的磷酸化，也不能下调NF-κB的表达。因此推测LFP-20是通过下调活化的巨噬细胞中与MyD88相互作用的信号分子而影响MyD88表达，如抑制MyD88上游分子TLR4等。LFP-20能抑制猪肺泡巨噬细胞中LPS所诱导的TLR4表达，主要是通过削弱LFP-20对LPS的细胞外结合来实现的[8]，但LFP-20能否抑制LPS与TLR4的结合活性目前尚无研究证实。此外，LFP-20也能通过MyD88抑制MAPK信号通路间接实现对NF-κB的调节，并影响炎症反应中的相关细胞因子的基因转录[22]。

2.1.2 TRAF6途径 Toshihiro等[18]研究表明，牛乳铁蛋白可下调LPS介导的NF-κB表达，其作用靶点不在MyD88，而在MyD88甚至IRAK1的下游；这些下游信号通过特异性结合TLR4受体的结构域来阻断TLR4的信号转导，并抑制IRAKI的降解；而当选择性抑制IKKβ时，则不能抑制IRAKI的降解。因此，IRAK1的降解需要IRAK1激酶的作用和自动磷酸化作用，说明牛乳铁蛋白的调控靶点位于IRAK1的下游。研究表明，牛乳铁蛋白是通过干扰TNF受体相关因子(TRAF6)的多聚泛素化来影响NF-κB活化的，且具有时间依赖性；LPS能明显引起小鼠间充质干细胞ST2细胞株TRAF6 Lys-63相关的泛素化，而预先用牛乳铁蛋白处理过的LPS则没有这种作用，TRAF6-TAK1复合物的形成也受到抑制，无法使IKK激活[23]。分析原因，可能是牛乳铁蛋白直接与ST2细胞株中的内源性TRAF6结合，从而阻断NF-κB的活化。但Oh等[24]研究表明，乳铁蛋白可通过上调TRAF6而促进NF-κB的表达；其机制可能是乳铁蛋白通过与TRAF6的环指或锌指区域结合，进而招募IKK复合物，最终使NF-κB(p65)磷酸化活性增强。

2.2 上调NF-κB表达 虽然大多数研究显示乳铁蛋白具有优良的抗炎特性，能抑制NF-κB的表达，但也有研究报道，乳铁蛋白可上调NF-κB的表达[7]。Ando等[7]研究表明，人乳铁蛋白在25～500 μg/mL(远低于生理浓度)时，可以不依赖于LPS或其经典的活化因子(如TNF或IL-1)，便能激活THP-1细胞株NF-κB的表达，与前述乳铁蛋白可下调NF-κB表达的结论不符。Ando等[7]认为，乳铁蛋白糖基化后与CD14形成LF-CD14复合物，一方面的确能干扰CD14-LPS复合物的形成，从而减弱LPS信号转导，下调NF-κB的表达；另一方面又能通过碳水化合物链激活TLR4，通过MyD88依赖和非依赖途径活化NF-κB。由MyD88介导的LF对NF-κB的活化过程，与生理调节过程相似；而在MyD88非依赖途径中，LF可通过TRIF来活化NF-κB。当TLR4激活TRIF后，TRIF可通过N端的TRAF6结合相关基序直接与TRAF6结合，其C端包含Rip同源基序，可与RIP1结合[25]。与MyD88依赖途径类似，TRAF6可活化TAK1，RIP1可通过多聚泛素化与TRAF6、TAK1形成复合物，导致NF-κB的活化[26]。但实际上，在TLR4介导LF对NF-κB的调节过程中，是先通过MyD88依赖途径，再通过TRIF途径而实现的[7]。

关于何种情况下乳铁蛋白上调和下调NF-κB表达的作用更为突出，可能与乳铁蛋白的浓度有关。研究表明，低浓度牛乳铁蛋白(0.1～1 g/L)能阻断NF-κB活化，进而减少IL-8分泌，显示出抗炎效应；而高浓度乳铁蛋白(10 g/L)则表现出促炎效应，上调NF-κB的表达[27]。有研究采用0.1、1、10 g/L的牛乳铁蛋白分别处理猪肠上皮细胞，发现当牛乳铁蛋白浓度为0.1 g/L时，NF-κB的表达基本不变；浓度为1～10 g/L时才会导致NF-κB活化，且10 g/L牛乳铁蛋白的激活速度要快于1 g/L[28, 29]。由此说明，乳铁蛋白上调或下调NF-κB的表达是具有浓度依赖效应的。此外，乳铁蛋白上调和下调NF-κB表达的作用也可能与其亚结构、细胞特性及生理状况有关。乳铁蛋白具有不同的亚结构，如碳水化合物链[7]和N端肽段[8]，可能对NF-κB的表达具有不同的调节效应。而不同类型的细胞，因其生物学特性和生理情况不同，对乳铁蛋白的作用也呈现出不同的反应。关于不同生理情况下何种亚结构对NF-κB表达的调节占主导地位，亟待研究。

综上所述，乳铁蛋白和NF-κB在结构和功能上密切相关。以NF-κB为节点，多种不同的信号通路相互沟通交联，不同物种、不同浓度的乳铁蛋白作用于不同的细胞，可通过不同的通路上调或下调NF-κB表达。关于乳铁蛋白对NF-κB的促进和抑制作用分别在何种情况下占主导地位以及深层次的调控机制仍有待于进一步研究。

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国家大学生创新训练计划项目(201510610114)；四川省科技支撑计划生物骨材料开发关键技术研究项目(2014SZ0019)。

孟姝(E-mail： dreamingsue@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.48.037

R341

A

1002-266X(2016)48-0106-04

2016-06-04)