植物体胚成熟发育外在影响因素研究进展

王 丽，张焕玲

(1. 陕西省太白林业局，陕西 太白 721600；2. 西北农林科技大学 林学院，陕西省林业综合实验室，陕西 杨凌 712100)



植物体胚成熟发育外在影响因素研究进展

王 丽1，张焕玲2*

(1. 陕西省太白林业局，陕西 太白 721600；2. 西北农林科技大学 林学院，陕西省林业综合实验室，陕西 杨凌 712100)

体胚发生是植物离体条件下形态建成的重要途径之一，体胚成熟培养是体胚发生中的关键阶段，关系到体胚再生植株得率大小。影响体胚成熟的外在因素较多，主要有植物生长调节、渗透调节物质、光照条件等。一般认为，较高浓度的渗透调节物质有利于体胚成熟；ABA有利于体胚成熟发育，尤其是和部分渗透剂结合使用，效果明显；高浓度的生长素和分裂素不利于体胚成熟发育；不同植物体胚成熟发育对光照条件要求不同，多数需要在黑暗或极弱光下进行；其他措施如空气干燥、低温贮藏、培养基中添加活性炭、硝酸银、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等也有利于体胚的成熟发育。

体胚；成熟发育；影响因素

体胚是植物组织培养中由胚性愈伤组织产生的类似合子胚结构的胚状体，体胚外面包以人工种皮，就是我们所说的人工种子[1]。体胚具有两极性结构，可以直接形成再生植株，在无性繁殖上具有一定的优越性。开展体胚发生研究，对于植物的基因工程、细胞工程、杂交育种、良种快繁、转基因受体和突变体筛选等具有重大价值，同时，有助于研究细胞离体培养中形态发生、细胞分化与胚胎发生等重大理论问题[1-3]。

植物体胚发生技术开始于1948年Curtis和Micho在兰属植物中的研究，之后，在其他许多植物组织培养中也发现有形成胚状体的现象，人们开始认识到体胚发生是植物离体培养除器官发生以外的又一基本途径[3-4]。尽管植物体胚发生的普遍性已在200多种植物中得到验证，且已有应用于生产实践的报道[4-5]，但得到再生植株的依然很少，尤其木本植物，较低的体胚萌发率依然是研究与应用中的瓶颈。影响体胚萌发的直接因素是体胚的成熟发育，体胚成熟过程中的畸形化发育和愈伤组织化以及玻璃化是阻碍其不能正常萌发的主要原因[4]。目前，专门研究体胚成熟发育的报道不多见，因此，探讨影响植物体胚成熟的各种因素，对体胚在木本植物中的正常应用具有重要意义。

1 植物生长调节剂

植物生长调节剂是对体胚发生影响最大、现有研究中讨论最多的因素。体胚发育顺序严格而不可逾越，但发育周期长短则因培养基及其中的植物生长调节剂种类与配比不同而有较大变化。因此，有意识地改变植物生长调节剂的种类和配比，可以加速体胚发育的进程。但是植物生长调节剂的使用同时会引起大量的畸形胚和畸形植株产生[6-9]。而且由于同一培养基中胚发育的不同步性，植物生长调节剂的加入甚至会引起相反的结果，因为体胚的不同发育阶段需要的植物生长调节剂种类和浓度不同[3,6,10]。

1.1 脱落酸(ABA)

促进体胚成熟最有效的植物生长调节剂是ABA[9]。一般认为，适当浓度的ABA可抑制不正常体胚的形成，防止胚状体的过早萌发，促进胚胎正常发育[10]。ABA可降低培养基中腐胺的水平，抑制体胚的过早萌发，增加了贮藏蛋白质的积累量，从而提高了体细胞的质量[11]。ABA对植物体胚发生的特异基因表达起调节作用，可激活有关基因表达，大量合成贮藏蛋白、胚胎特异性蛋白以及晚期胚胎丰富蛋白[12-13]。在针叶树的体胚成熟过程中，子叶胚的发育通常在附加ABA的培养基上促进后期原胚的成熟，形成4～5 mm长带有伸长子叶的体胚[14]。Pullman和 Gupta在胚的发育和成熟培养基中同时使用ABA(25～100 mg·L-1)和活性炭(0.05%～0.25%)使花旗松的体胚活力及形态建构都大为改善，产生大量高质量的子叶胚[15]。也有人认为ABA可能参与了碳水化合物的代谢[16]。B.Cuenca M.C.S an-Jose M.T.Martinez (1999)研究英国栎(Quercus robur)的体胚再生发现，在1/2MS培养基上高浓度的蔗糖(8%)与较高浓度的ABA(2.7 mg·L-1)结合使用成熟处理四周的体胚，转至含0.5 mg·L-1BA的 1/2MS培养基上体胚萌发率(根伸长)和转化植株率(根芽都伸长)达到43%和36%；而经1/2MS成熟的体胚尽管有35%的体胚长出根，但没有转化成植株[17]。

1.2 生长素

在体胚发生过程中研究最多的生长素是2,4-D、NAA和IBA。2,4-D对大多数植物的体胚诱导是必须的，但长时间培养在含2,4-D的培养基上易造成体胚再生能力的丧失。体胚成熟一般需要较低浓度的生长素，如在三叶草和芹菜诱导体胚发生及发育中发现，如不及时降低2，4-D的浓度，那么球形胚就产生次生胚，当次生胚发育到球形胚后又循环继续形成次生胚，由此形成分支的球形胚链，从而抑制体胚的正常发育，而被“锁”在一个特殊的发育阶段[18]。在荔枝的体胚再生研究也发现高浓度的2,4-D阻碍了体胚的进一步发育，而低浓度的NAA和IBA的配合使用有利于体胚的发育成熟[14]。

1.3 细胞分裂素

体胚成熟一般不需要或仅需要低浓度的细胞分裂素(常用的是6-BA和KT)参与，因为细胞分裂素的使用会促进次生胚的再生，而不利于体胚的成熟。陈智贤(1987)在棉花的体胚发生研究中认为，胚性愈伤组织的诱导需要一定浓度的生长素与细胞分裂素的配合使用，但体胚的成熟发育只需要细胞分裂素，浓度不能超过1 mg·L-1，否则会产生抑制作用[19]。

1.4 赤霉素

多数研究认为，体胚成熟过程中一般不加入GA3，它会促进体胚的畸形发育或早萌[20]。但有人认为GA3对体胚的诱导不是必须的，甚至具有抑制作用，但对胚胎进一步发育成熟或刺激根和小植株生长是有利的[21]。GA3与玉米素、ABA结合使用，可以促进页蒿体胚正常发育[20]。

2 渗透调节物质

渗透剂都是高度水合性的多羟基分子，在植物体胚发生的各个阶段发挥着重要作用，其中蔗糖和葡萄糖为常用的两种糖类渗透剂，高浓度的渗透调节物质能产生与ABA类似的作用。一般认为，高浓度的蔗糖有利于体胚发育成熟[22-26]，它不仅为体胚的发育提供能量，并作为一种渗透调节物质，引起细胞失水，使内含物升高，促进细胞发育。减少畸形胚的发生。也有相反的报道，龙眼体胚发生中，低糖浓度可减少畸形胚的产生[22]，这可能与不同植物种类体胚发育对碳源和渗透压的特殊要求有关[23]。

山梨醇、甘油、甘露糖醇、聚乙二醇(PEG)等也可用作渗透剂，促进体胚发生，并能防止其早熟萌发[25-29]。PEG等渗透剂是不能渗透细胞壁的高分子量化合物，可能会产生与干旱条件下形成相似的水分胁迫，促进体胚成熟[30]。已有证据表明， PEG、山梨醇等渗透剂与ABA和活性炭同时使用，对改善针叶树体胚成熟和储藏物质的形成十分有效[31]。白云杉的未成熟体胚在含ABA和PEG的培养基中培养4～8周，不但可抑制体胚早熟萌发，而且成熟同步化及频率明显提高；在同时添加山梨醇和ABA的培养基中，成熟体胚的数目是单独添加ABA的培养基中的两倍，同时添加甘露糖醇和ABA的培养基中，成熟体胚的数目比单独添加ABA增加了一倍[30,31]。栓皮槠体胚在添加6%山梨醇的MS培养基中处理3周后，转到不含山梨醇只含低浓度BAP的WPM培养基中能使萌发率达到20%，而在不含山梨醇的培养基中的的萌发率仅为1%[32]。刘桂珍在巴西橡胶体胚发生中用甘油代替蔗糖作为碳源，能明显促进体胚成熟[33]。

3 光照条件

已报道的影响体胚成熟的光照因素有光强和光质。一般认为，体胚成熟过程都是在黑暗或极弱光照下完成的[34]。邓向阳(2000)在光强对花生体胚发生及再生体系的建立研究中发现，光下体胚无明显的根端，芽端虽明显变绿，但往往发育不充分，停滞于鱼雷期或更早时期[35]。但也有相反的报道，杨金玲等(2000)在白杄体胚的悬浮培养中，将黑暗条件下产生的悬浮培养物转到光下进行体胚的成熟培养，30天后产生大量成熟子叶期体胚[36]。翁浩等(2013)在金花茶的体胚诱导中发现，白光利于体胚发育成熟，单质光不利于体胚发育成熟[37]。

4 其它因素

空气干燥、低温贮藏、活性炭、硝酸银、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等其他因素也影响体胚成熟过程。

干燥可以提高贮存后体胚的转化率[38]。将经ABA加PEG处理后的白云杉和黑云杉成熟体胚在相对湿度81%～43%甚至在空气中干燥两周后，使其含水量会从原来的60%～70%降至32%后再吸液，可使体胚转化率高达80%以上[30]。

低温对体胚的成熟和萌发也有促进作用。Manzanera J A(1992)将栓皮槠体胚置于铺有湿润的纤维素滤膜的封闭培养皿中5℃低温处理10周和22周，发现低温可有效地打破休眠，促进下胚轴伸长，然后将体胚转接在含低浓度6-BA的S培养基上，体胚上胚轴萌发得到再生植株[39]。

活性炭可吸附培养过程中产生的有毒代谢物和多余植物生长调节剂，对体胚发育有利，其最适的使用浓度为0.05%～0.25%。在子叶期胚发育培养基中同时加入ABA和活性炭，可使子叶胚产生一种与合子胚更加类似的顶端优势区，几周后即可形成大量粗壮的子叶胚[10]。

人们在培养基中加入有机添加物如CH(水解酪蛋白)来促进体胚的成熟发育，但CH对胚状体的诱导和发育还存在分歧，尽管一些实验表明CH的作用不明显，但有人认为，CH中含有NH4+，通过调节培养基渗透压而影响体胚发育[4]。此外，组培时白云杉通过在培养基中添加硝酸银[31]，栓皮栎通过添加硝酸银和PVP[26]，均有效促进了其体胚的成熟发育。

5 研究展望

以往研究中，因对成熟体胚形态并无统一的标准，均以成熟体胚具有较高萌发率作为判断体胚发育是否成熟的依据，但体胚萌发率不光受体胚成熟度的影响，还受其他因素如培养基成分、培养条件等的影响，这些因素是否会和影响体胚成熟发育的因素产生互作效应，进而影响实验结果，这应该是今后研究中需要考虑的。此外，很多研究报道提出了不少可以促进体胚成熟发育的因素，但缺乏对其促进机理的研究。只有探明其机理，才能从根本上解决体胚成熟发育不完全，萌发率低的瓶颈，今后不同因素影响体胚成熟发育机理应作为研究重点之一。

[1] 李浚明.植物组织培养教程(第一版)[M].北京：中国农业大学出版社,1999.

[2] 金晓玲,何平.乔木树种体细胞胚胎发生的研究与应用[J].林业科学研究,2003,16(3): 343-350.

[3] 崔凯荣,戴若兰.植物体细胞胚发生的分子生物学[M].北京：科学出版社，2000.

[4] 陈金慧,王洪云,诸葛强，等.林木体胚发生技术进展[J].林业科技开发,2000,14(3): 9-11.

[5] 刘福平,张小杭,崔寿福.植物人工种子研究概况[J].江西科学,2015,33(4):484-489.

[6] 曾超,代金玲,白玉娥,等.林木体细胞胚胎发生影响因子研究进展[J] .安徽农业科学,2014,42(16):5100-5103.

[7] 陈敏敏,张建军,周音,等.百合根外植体体细胞胚胎再生影响因素研究[J].核农学报,2015,29(8):1494-1501.

[8] 崔洪,郭仲琛,桂耀林.芹菜体细胞胚胎发生及干化体细胞胚的研究[J].植物学报,1993,35(增刊): 94-96.

[9] 陈夜江,赖钟雄.果树和林木体细胞胚胎发生的研究与利用[J].福建农业大学学报,2001,30(3): 420-426.

[10] Gupta PK,Pullman GS. Method for reproducing coniferous plants by somatic embryogenesis using abscisic acid and smotic potential variation [P]. U.S.Patent,No.5036007,1991.

[11] 李映红,郭仲琛.青杄在不同条件下的体细胞胚胎发生及苗的形成[J].植物学报,1990,32(7):568-570.

[12] Colorado P,Nicolas C,Nicolas G. Expression of three ABA-regulated clones and their relationship to maturation processes during the embryogenesis of chick-pea seeds[J]. Physiologia Plantorum,1995,94: 1-6.

[13] 陈雄,王亚馥.植物体细胞胚发生中基因表达调控研究的某些现状[J].遗传,1995,17(增): 34-38.

[14] 赖钟雄,桑庆亮.荔枝胚性愈伤组织发生系统的优化及转化抗性愈伤组织培养再生植株[J].应用与环境生物学报,2003,9(2):131-136.

[15] Pullman GS,Gupta PK. Method for reproducing conifer plants by somatic embryogenesis using adsorbent materials in the development stage media[P].U.S.Patent ,No,5034326,1991.

[16] Vasil V. Characterization of an Embryogenic cell suspension culture derived from cultured nflorescences of pennisetum americanum(Pearl Millet Gramumineae) [J]. Amer.j.Bot,1982,69:1441-1449.

[17] Cuenca B,San-Jose MC,Martinez MT,etal. Somatic embryogenesis from stem and leaf explant of Quercus robur L[J]. Plant Cell Report ,1999,18: 538-543.

[18] 崔凯荣,刑更生,周功克,等.植物植物生长调节剂对体细胞胚胎的诱导和调节[J].遗传,2000,22 (5) :349-354.

[19] 薛美风,郭余龙,李名扬,等.长期继代对棉花胚性愈伤组织体胚发生能力及再生植株变异的影响[J].西南农业学报,2002,15(4): 19-21.

[20] 刘华英,萧浪涛,何长征.植物体细胞胚发生与内源植物生长调节剂的关系研究进展[J].湖南农业大学学报,2002,28(4): 349-354.

[21] Ammirato PV. Techniques for Propagation and Breeding [M]// Evans DA et al .Handbook of plant cell culture.U.S.A. Macmillan Publ.，1983：82.

[22] 赖钟雄,陈振亮.龙眼胚性愈伤组织的高频率体细胞胚胎发生[J].福建农业大学学报,1997,26(3): 271-276.

[23] 黄学林,李筱菊.乙烯和多胺的生物合成与植物体细胞胚胎发生[J].植物生理学通讯,1995,31(2):81-85.

[24] 张宇.蔗糖对水曲柳体细胞胚发生的影响[J].防护林科技,2015(6):43-44.

[25] 吴丽君.湿地松体胚增殖与成熟培养研究[J].福建农业学报,2010,25(2):217-221.

[26] 张存旭,张焕玲,贾小明,等.栓皮栎体胚的增殖、成熟与萌发[J].林业科学,2008,44(6):39-45.

[27] Gupta PK.,Pullman GS. High concentration enrichment of conifer embryonal cells[P]. U.S.Patent,No.5041 382. 1991.

[28] Autorus TE,Fowke LC,Dunstan DI. Somatic embryogenesis in conifers[J]. Can J Bot,1991,69(9):1873- 1899.

[29] 吴丽君.火炬松成熟合子胚体胚发生与成熟试验[J].福建林业科技,2013,40(4):74-78.

[30] Fowke LC,Attree SM. Applied and basic studies of somatic embryigenesis in white spruce(Picea glauca) and black spruce(Picea mariana) [M]// Soh WY,Liu JR,Kamamine A. Advances in Development Biology and Biotechnology of Higher Plants. Korea：The Korean Soc Plant Tiss Cult,1993.

[31] Attree SM,Pomeroy MK,Fowke LC. Manipulation of conditions for the culture of somatic embryos of white spruce for improved triacylglycerol biosynthesis and disiccation tolerance[J]. Planta,1992,187(3) : 395-404.

[32] Vladimir Chalupa. Plant regeneration by somatic embryogenesis from cultured immature embryos of oak (\%Quercus robur\% L) and linden.(\%Tilia cordata \%Mill.) [J] . Plant Cell Report,1990,9(7): 398-401.

[33] 刘桂珍.巴西橡胶悬浮细胞培养胚胎发生与植株再生[J].热带植物学报,1999,20(4):1-5.

[34] 韩碧文,刘淑兰.植物离体体细胞胚胎发生[J].植物生理学通讯,1988(1): 9 -15.

[35] 邓向阳,卫志明.幼胚长度、2,4-D浓度、光强度对花生体细胞胚发生的影响及高效再生系统的建立[J]. 植物生理学报,2000,26(6): 525-531.

[36] 杨金玲,桂耀辉,郭仲琛.白杄体细胞胚悬浮培养的动力学研究[J].生物工程学报,2000,16(2): 218 - 220.

[37] 翁浩,赖钟雄.不同因素对金花茶体胚成熟的影响研究[J].园艺与种苗,2013(7):39-34.

[38] 周丽侬,曹静.园艺植物体胚发生及植株再生技术研究[J].热带作物学报,1998,19(2): 15-19.

[39] Manzanera JA,Astorrga R ,Bueno MA. Somatic embryo induction and germination in \%Quercus\% L [J]. Silvae Genetica ,1993,42(2-3):90-93.

External Factors Affecting Somatic Embryos Maturation of Plants

WANG Li1,ZHANG Huan-Ling2*

(1.TaibaiForestryBureauofShaanxi,TaibaiShaanxi721600; 2.ShaanxiForestryKeyLaboratory,CollegeofForestry,NorthwestA&FUniversity,YanglingShaanxi712100)

Somatic embryogenesis is one of the most important methods on plant morphogenesis in vitro. Maturation is the critical stage during somatic embryogenesis,which related directly to re-generated plant yield. There are many external factors affecting somatic embryo maturation,mainly including plant growth regulators,osmotic adjustment substances,lights and so on. Generally speaking,high concentration of osmotic adjustment substances is beneficial to somatic embryos maturation,and ABA,especially combined with portion of osmotic adjustment substances has obviously effect in maturation,nevertheless high concentration of auxin and cytokinin has opposite effect. Different plant require imparity light during somatic embryos maturation,most of them mature in dark or under very weak light. Other measures such as air drying,cold storage,special additives as activated carbon,argentums nitricum,polyvinylpyrrolidone (PVP) on medium also benefit somatic embryos maturation.

Somatic embryos; maturation; affecting factors

2016-05-18

陕西省林业综合实验室开放课题“几种重要树种工厂化育苗技术研究”

王丽(1973-)，女，陕西榆林人，林业工程师，主要从事森林资源管理方面的工作。

S722.8

A

1001-2117(2016)05-0074-04

*通讯作者