肝硬克颗粒中丹酚酸B的含量测定

王如意　　黄百祺　　林素兰.广东食品药品职业学院实验实训中心，广东广州　5050；.广东科贸职业学院生物技术系，广东广州　50430



肝硬克颗粒中丹酚酸B的含量测定

王如意1黄百祺2林素兰1
1.广东食品药品职业学院实验实训中心，广东广州510520；2.广东科贸职业学院生物技术系，广东广州510430

[摘要]目的探讨用高效液相色谱法测定肝硬克颗粒中丹酚酸B的含量。方法采用岛津C18色谱柱（Diamonsil（钻石）C18，250mm×4.6mm，5μm），柱温：30℃，检测波长：286 nm；流动相：甲醇-乙腈-甲酸-水（30∶10∶1∶59）。结果丹酚酸B的线性范围为19.8～99.0μg/mL，回归方程为Y=14328C-6710.3（r=0.9998）；平均回收率为96.85%，RSD为0.77%。结论本法结果准确，专属性强，操作简便，成本低，适合于肝硬克颗粒中丹酚酸B含量的测定。[关键词]丹酚酸B曰肝硬克颗粒曰高效液相色谱法曰含量测定

肝硬克颗粒是由丹参、黄芪等多味中药经不同溶剂提取成浸膏，加以辅料混合而制成的复方制剂，具有清热解毒、活血化瘀、软坚散结之功效，用于慢性乙型肝炎，防治肝炎后肝纤维化及早期肝硬化。丹参为本方中的君药，生产时以水作为溶媒，低温下超声提取2次，滤液减压浓缩得到湿浸膏，主要含脂溶性的二萜醌类和水溶性的酚酸类，这两类成分均为丹参的有效成分[1]。酚酸类成分包括丹酚酸A，丹酚酸B，丹酚酸C等。其中丹酚酸B是含量最高的活性成分。文献记载表明[2-8]，丹酚酸B具有抗凝、抗氧化等活性，具有抗肝纤维化、抗动脉粥样硬化和改善记忆功能障碍等作用。

丹酚酸B（salvianolic acid B），也叫丹参酚酸B、丹参酸乙等。药理研究和文献记载表明[17-22]，丹酚酸B具有抗凝、抗氧化的活性，具有抗肝纤维化、抗动脉粥样硬化和改善记忆功能障碍等作用。丹酚酸B可能通过下调肝组织转化生长因子-β1（TGF-β1）表达抑制胶原的合成，同时下调TIMP-2表达而使胶原分解加强，从而减轻肝纤维化的程度，对肝纤维化的形成有明显的抑制作用，并推测丹酚酸B抗肝纤维化的部分机制在于抑制了活化贮脂细胞的增殖，并通过抑制贮脂细胞生成细胞外基质而减少了胶原纤维在肝内的沉积，以及干扰了狄氏间隙基底膜的形成而减轻了肝窦毛细胞血管化等，改善纤维化肝脏的脂质过氧化损伤并降低肝组织MMP-2活性是丹酚酸B盐预防肝纤维化的重要作用机制。

肝硬克颗粒在申报时，君药丹参只验证了其脂溶性主要活性成分丹参酮ⅡA的含量测定方法，而丹酚酸B的含量检测对于药物质量控制非常重要。鉴于丹酚酸B的重要性，以及各个药物制剂中的生产工艺、制剂处方均不一样，各药剂的分析方法需经过验证，证明采用的方法适合于相应的检测要求是必要的。

1　仪器与试药

1.1仪器设备

UV-240型紫外可见分光光度计（日本岛津公司），LC10AT高效液相色谱仪（日本岛津公司），SPDIOAVP紫外可见检测器（浙大N2000色谱工作站），AUY220电子天平（日本岛津公司）等。

1.2试药与药品

丹酚酸B对照品（购自中国食品药品检定研究院；批号：111562-201212），肝硬克颗粒（深圳同安药业公司生产；批号：131101、131102、131103、小试1.131201、小试2.131202、小试3.131203）。乙腈、甲醇、甲酸为色谱纯，其他试剂均为分析纯，

2　色谱条件与系统适用性试验

2.1检测波长的选择

以水为空白溶液，取丹酚酸B对照品溶液（50μg/mL），在200～400 nm的波长范围内进行紫外扫描，丹酚酸B在204 nm和286 nm处有最大吸收，考虑204 nm处于近紫外区的末端，末端干扰较大，故选择286 nm为检测波长。

2.2系统使用性试验

色谱柱以十八烷基键合硅胶为填充剂；甲醇-乙腈-甲酸-水（30∶10∶1∶59）为流动相；流速1.0 mL/min；检测波长为286 nm；柱温30℃；进样量20μL。在此色谱条件下丹酚酸B的分离度为1.85。

3　方法与结果

3.1对照品溶液的制备

取丹酚酸B对照品适量，精密称定，加水制成每毫升含60μg的溶液，即得。

3.2供试品提取方法的选择

文献表明，丹参生药中丹酚酸B的提取以70%甲醇的提取率最高，其次是70%乙醇，水的提取率相对较低。但是3种提取溶剂差异并不是特别显著，水的提取率也为70%甲醇的95.06%，加上水的成本低，又不造成环境污染[9]。且考虑到丹酚酸B对热不稳定，其丹参水提液在长时间受热中，丹酚酸B的含量大大降低[10]。故采用冰浴超声法对样品进行前处理。

取同批供试品0.6 g，精密称定，置50mL量瓶中，加30mL溶剂，超声处理，放冷，加溶剂至刻度，摇匀，离心，取上清液，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得。（溶剂分别为70%甲醇和水，超声时间分别为15、30、45 min，冰浴保温），结果如表1所示。结果表明，用70%甲醇和纯水超声提取30 min后测得的含量相等，故样品处理采用纯水超声提取30min。

3.3专属性试验

按处方中药味比例组成，取除丹参外的其余药材，按制备工艺要求制成不含丹参的阴性样品，再按”3.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.2”项下色谱条件测定，结果在供试品的色谱图（图1C）中，在与对照品色谱峰（图1A）相应位置上，有相同保留时间的色谱峰，而阴性对照溶液的色谱图在此保留时间处未见明显的色谱峰（图1B），故认为无干扰。见图1。

溶剂种类　　超声时间（min）　　丹酚酸B含量Cx（mg/g）70%甲醇纯水15 30 45 15 30 45 5.04 5.33 5.31 5.13 5.33 5.24

3.4线性关系考察

精密称取丹酚酸B对照品4.95mg，加水制成浓度为99.0μg/mL的丹酚酸B对照溶液。精密量取上述对照品溶液加水制成浓度分别为19.8、39.6、59.4、79.2、99.0μg/mL的丹酚酸B对照溶液，分别精密吸取上述系列溶液各20μL进样测量，按“2.2”项下色谱条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标，丹酚酸B量（μg）为横坐标，绘制标准曲线，得标准曲线为Y=14328X-6710.3，r=0.9998，表明丹酚酸B在19.8～99μg/mL浓度范围内与峰面积值有良好的线性关系。

3.5精密度试验

取同一批样品，按“3.2”项下方法制成供试品溶液，精密吸取同一供试品溶液，在“2.2”项下的色谱条件下进样20μL，重复进样6次，记录色谱图的峰面积，计算RSD为0.32%（n=6），表明仪器精密度良好。

3.6稳定性试验

取供试品溶液，室温下放置，分别在0、2、4、8、12、24 h吸取20μL进样考察，按“2.2”项下色谱法测定丹酚酸B的峰面积，计算RSD为1.21%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

3.7重复性试验

精密称取供试品3份，按“3.2”项下方法操作，在“2.2”项下色谱条件下进行分析测定，计算丹酚酸B 的RSD为1.65%，结果表明该方法重复性良好。

3.8加样回收率试验

取已知含量的样品（批号：131102）适量，精密称取0.3 g，共6份，置50 mL量瓶中，分别精密加入丹酚酸B对照品溶液25mL，超声处理30min，放冷，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，离心，经0.45μm微孔滤膜过滤，按“2.2”项下色谱条件测定，采用外标法求出丹酚酸B的含量，计算回收率，结果表明本实验确定的丹酚酸B含量测定方法的准确度较好。见表2。

图1　丹酚酸B对照品、阴性样品、样品色谱图

表2　丹酚酸B回收率测定结果

3.9样品含量测定

按“3.2”项下方法制备供试液，测定3批成品和3批小试样品中丹酚酸B的含量，每样平行测定3次，实验表明，与肝硬克颗粒成品相比，小试样品的丹酚酸B的含量较高，但丹酚酸B混合较不均匀。见表3。

4　讨论

考虑样品中的丹酚酸B是丹参的水溶性活性成分，故在提取时比较了不同溶剂、不同时间的冰浴超声、水煮加热回流的对比试验。结果表明用70%甲醇比水的提取率要高，但低于用超声法处理的提取率，且随着加热回流处理时间的增加，含量逐渐降低。由此可见，用水作为溶剂，冰浴超声法提取肝硬克颗粒中丹酚酸B，操作简单且避免了因丹酚酸B的热不稳定性而造成的损失，超声时间定在30min为宜。

测定肝硬克颗粒样品中丹酚酸B的含量时，小试的含量较高，但是混合较不均匀；成品的含量比小试的含量低，但是混合较均匀。可能是丹酚酸B的对热不稳定性，所以在成品混合过程中，丹酚酸B分解。因此在以后生产中，要注意成品混合时温度的控制，保证成品中丹酚酸B的含量。

综上所述，本试验用水作为溶剂、冰浴超声提取肝硬克颗粒中的丹酚酸B，并用高效液相色谱法测定其含量，结果准确、专属性强、操作简便、成本低，适合于肝硬克颗粒中丹酚酸B含量的测定。

表3　样品的含量测定结果（n=3）

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Content determ ination of salvianolic acid B in Ganyingke Granules

WANG Ruyi1HUANG Baiqi2LIN Sulan1
1.Experimental and Training Centre,Guangdong Food and Drug Vacational College,Guangdong Province,Guangzhou 510520,China;2.Department of Biotechnology,Guangdong Vacational College of Science and Trade,Guangdong Province,Guangzhou 510430,China

[Abstract]Objective To evaluate amethod for the determination of salvianolic acid B in Ganyingke Granules by high performance liquid chromatography(HPLC)method.M ethods Determination was conducted at 30°C and at 286 nm with a C18column(SHIMADZU,Diamonsil,250 mm×4.6 mm,5μm),and methanol-acetonitrile-formic acid-water (30∶10∶1∶59)was used asmobile phase.Results The regression equation was Y=14328C-6710.3(r=0.9998)with a linear range from 19.8 to 99.0μg/mL,average recovery was 96.85%,and RSD was 0.77%(n=6).Conclusion This method is accurate and easy to operate with good specificity,which is suitable for the content determination of salvianolic acid B in Ganyingke Granules.

[Key words]Salvianolic acid B;Ganyingke Granules;High performance liquid chromatography;Content determination

收稿日期：（2015-09-28本文编辑：赵鲁枫）

[通讯作者]黄百祺（1983-），男，硕士，从事生物技术研究。

[作者简介]王如意（1983-），男，硕士，从事天然药产物研究。

[基金项目]广东省中医药局科研课题项目（20141199）。

[中图分类号]R927.2

[文献标识码]A

[文章编号]1673-7210（2016）01（a）-0039-04