WNK3激酶高表达对白介素-1β诱导HEK293细胞凋亡的保护作用

王德选，叶晓华，余灵芳，林洪洲，庄捷秋，杨青，郑雯洁

（温州医科大学附属第二医院育英儿童医院 小儿肾内科，浙江 温州 325027）



WNK3激酶高表达对白介素-1β诱导HEK293细胞凋亡的保护作用

王德选，叶晓华，余灵芳，林洪洲，庄捷秋，杨青，郑雯洁

（温州医科大学附属第二医院育英儿童医院 小儿肾内科，浙江 温州 325027）

[摘 要]目的：观察WNK3激酶高表达对白介素-1β（IL-1β）诱导人胚肾细胞（HEK293细胞）凋亡的作用。方法：HEK293细胞分为3组：Vector+NS组、Vector+IL-1β组和WNK3+IL-1β组。Vector+NS组、Vector+IL-1β组转染对照Vector，WNK3+IL-1β组转染WNK3。药物干预时，Vector+NS组加入等量0.9%氯化钠溶液，Vector+IL-1β组、WNK3+IL-1β组加入10 ng/mL IL-1β。分别于培养0、12、24、36和48 h时，采用CCK-8试剂盒检测细胞活性。孵育0、18、36 h时应用Western blot法检测Caspase-3、cleaved Caspase-3、Caspase-9、cleaved Caspase-9等凋亡蛋白。在IL-1β干预0、30、60 min时采用Western blot法检测JNK通路蛋白。结果：Vector+IL-1β组在给药后细胞活性逐渐下降，在48 h达到最低值，WNK3+IL-1β组下降幅度较缓和，与同时间点Vector+IL-1β组比较细胞活性回升，在48 h时差异有统计学意义（P＜0.01）。IL-1β孵育后cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9表达量增加。与36 h的Vector+IL-1β组比较，WNK3+IL-1β组的cleaved Caspase-3显著减少，2组的cleaved Caspase-9在18 h及36 h时差异亦存在统计学意义（P＜0.05）。WNK3转染后p-JNK的表达水平较未转染WNK3组的上升幅度降低（P＜0.05）。结论：IL-1β诱导HEK293细胞活性下降，而转染WNK3质粒可以有效逆转部分细胞活性。WNK3激酶通过减少JNK的磷酸化抑制Caspase途径的活化，减少细胞凋亡，起到在不利条件下保护肾脏细胞的作用。

[关键词]WNK3；JNK；白介素-1β；肾脏；凋亡

肾脏是维持水和电解质平衡的重要脏器，但也极易受到缺血低氧、药物等各种因素的影响，进而引起肾脏不同细胞的功能受损，甚至细胞凋亡或坏死。WNKs激酶[with no lysis（K）kinase]是一种新型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族。研究提示WNKs激酶构成了一些新的信号通路，涉及人体各种离子转运体和通道的调节[1]。WNK3激酶是WNKs 4个家族成员之一，可在细胞水平上调节钠氯共转运子（Na+-Cl--contransporter，NCC）的表达，而肾脏的NCC主要分布于远曲小管，是肾小管重吸收钠离子的通道蛋白之一[2]。目前国内外研究[3-4]多倾向于抑制WNK3激酶，进而减少肾脏对钠离子的吸收，以达到控制高血压的目的。但也有研究[5-6]显示WNK3激酶可能对某些细胞的凋亡有一定的保护作用，如子宫颈癌细胞、神经细胞元细胞等，因此，过度抑制WNK3激酶表达可能会带来一些负效应。WNK3激酶对人肾脏细胞的凋亡有无保护作用，目前鲜见相关报道。本研究主要观察WNK3对白介素-1β（IL-1β）诱导HEK293细胞凋亡的影响。

1　材料和方法

1.1材料 HEK293细胞（人胚肾细胞）为上海长征医院梅长林教授惠赠。空白对照质粒pCMV-HAVector、重组实验质粒pCMV-HA-WNK3均由美国EMORY大学肾内科蔡晖教授惠赠。IL-1β（recombinant human IL-1beta，200-01B）购自Peprotech。CCK-8分析试剂盒购于日本Dojindo Laboratories。Caspase-9（可同时检测cleaved Caspase-9）、Caspase-3、cleaved Caspase-3抗体、p-JNK、t-JNK等抗体均为美国Cell Signal Technology产品。羊抗兔和羊抗鼠二抗购自美国Jackson ImmunoResearch。DMEM、OPTI-MEM培养基为美国Gibco公司产品。胎牛血清购自杭州四季青公司。Lipofectamine 2000为Invitrogen公司产品。其余试剂均为市售分析纯。

1.2CCK-8法检测不同干预条件下HEK293细胞活性

1.2.1细胞培养：HEK293细胞接种于培养皿中，在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养液中传代培养。细胞培养箱条件为37 ℃，5% CO2及饱和湿度。每2 d更换培养液。取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2细胞分组及转染：取对数生长期的HEK293细胞悬液传代于φ6 cm培养皿（分为Vector+NS组、Vector+IL-1β组、WNK3+IL-1β组），根据Lipofectamine 2000试剂盒操作步骤，待细胞生长密度在40%时按表1剂量进行质粒DNA转染。转染4 h后换成正常培养液。

表1　细胞分组及质粒DNA转染剂量表

1.2.3CCK-8法测定细胞活性：细胞转染4 h后换成正常培养液继续培养20 h，细胞以1×104个细胞/每孔的密度重新接种于96孔板，参考预实验及文献[7]用药剂量，加药组培养液为DMEM+10% FBS+10 ng/mL IL-1β，每孔100 μL；对照组培养液为等量DMEM+10% FBS。于37 ℃孵箱中孵育0、12、24、36 和48 h时，换成10 μL CCK-8+100 μL DMEM正常培养液（每个时间点设5个复孔）。以加入等量CCK-8溶液、药物以及细胞培养液，但不含细胞的孔作为空白对照。在37 ℃细胞培养箱内继续孵育1.5 h（避光）。使用酶标仪测定每孔的吸光度值（OD值），测定波长为450 nm。细胞活力（%）=[A（加药）-A（空白）]/[A（0加药）-A（空白）]×100。A（加药）：加有CCK8溶液、细胞和药物溶液的孔的吸光度。A（空白）：加有CCK8溶液和培养基而没有细胞的孔的吸光度。A（0加药）：没有药物溶液，但加有细胞、CCK-8溶液的孔的吸光度。

1.3WNK3激酶对不同干预条件下HEK293细胞形态学的影响 取1×104的HEK293细胞悬浊液传代于3 盘φ6 cm培养皿，转染方案同1.2.2，转染后20 h再次以1×104悬液分别接种于3盘φ6 cm培养皿，使药物干预时3盘细胞密度相同，加药方案见表1。0 h 和36 h时在光学倒置显微镜下观察细胞形态学变化。

1.4Western blot法测定WNK3激酶过表达对HEK293细胞凋亡蛋白及JNK蛋白的影响

1.4.1细胞干预及蛋白收集：细胞分组及转染方案同1.2.2，每组3盘，于孵箱中孵育0、18、36 h时收集细胞蛋白检测Caspase系列凋亡蛋白。另重新按上述方案传代及转染3组细胞，在IL-1β干预0、30、60 min时收集细胞，裂解后检测JNK蛋白。

1.4.2Western blot法测定：预冷PBS洗涤细胞3次，转入EP管，加入RIPA细胞裂解液。置于冰上裂解30 mim。12 000 r/min低温离心20 min，吸取上清液至另一离心管。取20 μL用作蛋白定量检测，其余蛋白作变性处理。方法如下：用80 ℃水浴预热1 份6×Loading Buffer后，与5份蛋白样品充分混匀，将混合物于100 ℃中煮沸5 min，以变性蛋白。每孔40 μg蛋白样品。10%聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳时，每孔加入40 μg蛋白样品。浓缩胶电压设定为70 mV，分离胶电压升至120 mV。冰浴下恒流300 mA转膜（PVDF膜）90 min，依次孵育一抗（4 ℃过夜，一抗稀释浓度均为1:1 000）、二抗（室温，2 h，稀释浓度1:12 000），ECL显色。根据蛋白不同选择相应的曝光时间，使用凝胶图像处理系统对目的条带的分子量和净光密度值进行分析。以上所有实验重复3次。

1.5统计学处理方法 数据分析采用统计学软件SPSS20.0。所有定量资料以±s表示。定量资料多组间比较采用ONE-WAY ANOVA；多重比较，方差齐性采用LSD检验，方差不齐采用Dunnett T3检验。两因素的分析采用析因分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1CCK-8法检测WNK3过表达对IL-1β干预下HEK293细胞活性的影响 结果显示，Vector+NS组予等量0.9%氯化钠溶液干预0～48 h，细胞活性变化差异无统计学意义（P＞0.05）。而Vector+IL-1β组在给予10 ng/mL IL-1β后细胞活性即开始逐渐下降，在24 h时，与同组0 h时比较差异有统计学意义（P＜0.05），在48 h时达到最低值（P＜0.01）。WNK3+IL-1β组下降幅度较缓和，在36和48 h时与同组0 h时比较差异有统计学意义（均P＜0.05），但与同时间点Vector+IL-1β组比较细胞活性有所回升，在48 h时差异有统计学意义（P＜0.01），见表2。

表2　IL-1β诱导HEK293细胞不同时间点的活性（n=6，±s，%）

2.2WNK3过表达对IL-1β干预下HEK293细胞形态的影响 结果显示，在0 h相同接种密度前提下，Vector+IL-1β组36 h细胞密度明显比Vector+NS组低，其细胞伸张程度较低，部分细胞形态接近圆形，细胞内空泡较多。WNK3+IL-1β组细胞密度较Vector+IL-1β组增高，细胞内空泡减少，且部分细胞呈椭圆形或梭性。见图1。

2.3WNK3过表达对IL-1β诱导HEK293细胞凋亡各时间点相关凋亡蛋白表达的影响 结果显示：Vector+ NS组在等量0.9%氯化钠溶液干预过程中Caspase-3变化差异无统计学意义（P＞0.05），未检测到剪切后的Caspase-3及Caspase-9。而Vector+IL-1β组在给药后18 h Caspase-9和Caspase-3表达量开始逐渐下降，干预开始即检测到较为显著的cleaved Caspase-9，18 h到达高峰，36 h略有下降，同时在36 h时检测到较为显著的cleaved Caspase-3。与36 h的Vector+IL-1β组比较，WNK3+IL-1β组的cleaved Caspase-3显著减少（蛋白条带灰度量化值815.80±63.44 vs 350.33±51.52，P＜0.01），2组的cleaved Caspase-9在18 h（791.96±92.26 vs 349.88±97.40）及36 h（308.89±45.76 vs 103.98±36.03）时差异有统计学意义（均P＜0.05）。见图2。

图1　WNK3过表达对IL-1β干预下HEK293细胞形态的影响（×200，箭头示细胞内空泡）

图2　IL-1β诱导HEK细胞凋亡过程中Caspase-3及Caspase-9蛋白变化

2.4WNK3过表达对HEK293细胞凋亡中JNK通路的影响 结果显示：Vector+NS组在等量0.9%氯化钠溶液干预1 h内没有检测到显著的磷酸化JNK（p-JNK），IL-1β干预后，Vector+IL-1β组p-JNK在30 min开始显著增加。与Vector+IL-1β组比较，WNK3转染后p-JNK的表达水平在30 min（1 068.67±60.29 vs 603.33±70.94）和60 min（1 183.12±142.91 vs 775.50±107.48）显著降低（均P＜0.05），见图3。

图3　IL-1β诱导HEK细胞凋亡过程JNK通路蛋白变化

3　讨论

IL-1β属多肽类生长因子，主要由单核细胞和巨噬细胞产生，它能直接启动凋亡的细胞内过程，具有强烈的诱发细胞凋亡作用[8]。故本实验选取IL-1β作为激活MAPKS通路及促进细胞内源性凋亡的诱导剂，观察WNK3对IL-1β诱导的细胞凋亡有无保护作用。CCK-8结果显示IL-1β能促使HEK293细胞的活性下降，而转染WNK3可以有效逆转细胞活性。细胞形态学观察提示WNK3过表达有利于细胞增殖和细胞形态的维持。

WNK3在体内参与肾脏钠离子的吸收、细胞骨架形成、细胞凋亡及肿瘤细胞的侵袭转移等[9-10]。既往研究表明转染WT（野生型）-WNK3质粒的子宫颈癌细胞，在actinomycin-D诱导凋亡处理下的存活时间显著长于没有转染WT-WNK3质粒的子宫颈癌细胞，表明WNK3可延长细胞存活时间，延缓细胞凋亡[5]。除此之外，有学者报道Lingo-1受体能通过抑制WNK3的活性而促进神经细胞的凋亡，推断WNK3在神经细胞中也具有抗凋亡作用[6]。

细胞凋亡的外源性途径的活化是通过特定的死亡配体与细胞表面的死亡受体相互作用而介导的，可招募胞质中的procaspase-8，使其通过自身剪切而活化，激活下游的效应Caspase，如：Caspase-3、Caspase-6等，以剪切胞浆和核底物，诱导细胞发生凋亡。凋亡的内源性途径主要通过线粒体介导，当细胞受到应激刺激时，一些促凋亡蛋白如Bcl-2等从线粒体被释放入胞浆，与凋亡激活因子Apaf-1结合，将Caspase-9前体活化，继而诱导下游Caspase-3 及Caspase-7的活化，引发凋亡程序[11-12]。因此，Caspase-3是两条途径的下游共同关键调控凋亡蛋白。本研究结果显示，在10 ng/mL的IL-1β诱导下，HEK293细胞中剪切后的Caspase-9和Caspase-3显著上调，Caspase-3的剪切体在36 h、Caspase-9剪切体在18 h时表达增强达到高峰，而cleaved Caspase-9在IL-1β诱导36 h时表达反而有一定的降低，这可能是细胞在凋亡晚期时，Caspase已经执行完任务，其生理功能开始降解，细胞大多进入凋亡晚期的情况有关。这说明IL-1β可以通过内源性途径诱导HEK293细胞发生凋亡。WNK3过表达主要通过凋亡的内源性途径，抑制Caspase-9前体活化，并使下游Caspase-3活化减少，使相关凋亡蛋白表达程度下降，起到一定的抗凋亡作用。

JNK信号通路是MAPK中重要的通路之一。JNK通路的激活与多种系统的促凋亡作用有关。其中一条途径是通过磷酸化c-Jun和ATF-2激活转录因子AP-1，引起FasL表达增强，促进细胞凋亡。另一途径是通过磷酸化Bcl-2和Bcl-xL，促进线粒体释放细胞色素C，从而激活Caspase级联反应，导致细胞凋亡[13]。本研究中IL-1β激活HEK293细胞的JNK，引起Caspase级联反应，最终导致细胞凋亡。WNK3过表达主要通过抑制JNK磷酸化，减少Caspase-3、Caspase-9的剪切激活，减轻肾脏细胞凋亡程度，提升HEK293细胞在外界不利因素刺激下的存活率。

总之，WNK3激酶可抑制HEK293细胞的JNK磷酸化，通过Caspase途径减少肾脏细胞凋亡。虽然目前国际上主流观点认为WNK3主要负责肾脏钠离子的吸收，与高血压的发生发展有关，主要关注如何对其进行下调[14-16]，但本研究也显示WNK3具有保护肾脏细胞在不利条件下的生存能力，故建议在调控过程中避免对其进行过度抑制，以免影响肾脏细胞生存能力。

参考文献：

[1]ZHOU B,WANG D,FENG X,et al.WNK4inhibits NCC protein expression through MAPK ERK1/2 signaling pathway[J].Am J Physiol Renal Physiol,2012,302(5):F533-539.

[2]CHENG L,WU Q,KORTENOEVEN M L,et al.A systems level analysis of vasopressin-mediated signaling networks in kidney distal convoluted tubule cells[J].Sci Rep,2015,5(4):12829.

[3]GLOVER M,O’SHAUGHNESSY K M.SPAK and WNK kinases:a new target for blood pressure treatment?[J].Curr Opin Nephrol Hypertens,2011,20(1):16-22.

[4]MCDONOUGH A A.Mechanisms of proximal tubule sodium transport regulation that link extracellular fl uid volume and blood pressure[J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol,2010,298(4):R851-861.

[5]VERÍSSIMO F,SILVA E,MORRIS J D,et al.Protein kinase WNK3increases cell survival in a caspase-3-dependent pathway[J].Oncogene,2006,25(30):4172-4182.

[6]ZHANG Z H,XU X H,XIANG Z H,et al.LINGO-1 receptor promotes neuronal apoptosis by inhibiting WNK3kinase activity[J].J Biol Chem,2013,288(17):12152-12160.

[7]王玉,李晓玫,王海燕.白介素-1β通过JNK/p38信号转导通路调控肾系膜细胞表达α-平滑肌肌动蛋白[J].生理学报,2002,54(3):244-250.

[8]WANG L,GAI P,XU R,et al.Shikonin protects chondrocytes from interleukin-1beta-induced apoptosis by regulating PI3K/Akt signaling pathway[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(1):298-308.

[9]徐宁,王德选.WNK3激酶与肾小管钠离子转运[J].国际泌尿系统杂志,2015,35(1):123-126.

[10]LAGNAZ D,ARROYO J P,CHÁVEZ-CANALES M,et al.WNK3abrogates the NEDD 4-2-mediated inhibition of the renal Na+-Cl-cotransporter[J].Am J Physiol Renal Physiol,2014,307 (3):F275-286.

[11]ZAMAN S,WANG R,GANDHI V.Targeting executioner procaspase-3 with the procaspase activating compound BPAC-1 induces apoptosis in multiple myeloma cells[J].Exp Hematol,2015,S0301-472X(15):531-537.

[12]SINGLA N,DHAWAN D K.Zinc down regulates Apaf-1-dependent Bax/Bcl-2 mediated caspases activation during aluminium induced neurotoxicity[J].Biometals,2015,28(1):61-73.

[13]CAO J,CHEN J,XIE L,et al.Protective properties of sesamin against fl uoride-induced oxidative stress and apoptosis in kidney of carp (Cyprinus carpio) via JNK signaling pathway[J].Aquat Toxicol,2015,167:180-190.

[14]OI K,SOHARA E,RAI T,et al.A minor role of WNK3in regulating phosphorylation of renal NKCC2 and NCC cotransporters in vivo[J].Biol Open,2012,1(2):120-127.

[15]PACHECO-ALVAREZ D,VAZQUEZ N,CASTANEDABUENO M,et al.WNK3-SPAK interaction is required for the modulation of NCC and other members of the SLC12 family[J].Cell Physiol Biochem,2012,29:291-302.

[16]HAAS B R,CUDDAPAH V A,WATKIN S,et al.With-No-Lysine Kinase 3(WNK3) stimulates glioma invasion by regulating cell volume[J].Am J Physiol Cell Physiol,2011,301(5):1150-1160.

（本文编辑：丁敏娇）

·论 著·

The protective effect of WNK3kinase on apoptosis in HEK293 cell induced by interleukin-1β

WANG Dex-uan,YE Xiaohua,YU Lingfang,LIN Hongzhou,ZHUANG Jieqiu,YANG Qing,ZHENG Wenjie.Department of Pediatrics,the Second Affi liated & Yuying Children’s Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325027

Abstract:Objective:To observe the effect of high expression of WNK3on apoptosis in HEK293 cells induced by interleukin-1β.Methods:The HEK293 cells were divided into 3 groups (Vector+NS group,Vector+IL-1β group and WNK3+IL-1β group),then tansfection was performed.Liposome 2000 was added to the 1stand 2ndgroup with PCMV-HA-Vector as the blank and negative control respectively; WNK3was added to the 3rdgroup.After treated with 10 ng/mL IL-1β (the 2ndand 3rdgroup) or the same amount of normal saline (the 1stgroup),the CCK8 analysis was performed for the detection of cell activity after incubation for 0 h,12 h,24 h,36 h and 48 h at 37 ℃ respectively.Cell proteins were collected after 0 h,18 h and 36 h incubation respectively for detection of Caspase-3,Cleaved Caspase-3,Caspase-9,Cleaved Caspase-9.In addition,cell protein were collected 0 min,30 min and 60 min after the treatment of IL-1β for JNK detection.Results:No signifi cant difference of cell activity was observed in the Vector+NS group within 48 h.In the Vector+IL-1β group,cell activity began to decline soon after administration.Signifi cant difference could be found after 24 h and the cell activity reached the lowest at 48 h (P＜0.01).Cell activity of WNK3+IL-1β group declined in a moderate manner and the signifi cant difference appeared at 36 h and 48 h when comparing with that at 0 h in the same group (both P＜0.05).However,in comparison with the Vector+IL-1β group at the same time point,cell activity of WNK3+IL-1β group was still a little higher and the signifi cant difference could be observed at 48 h (P＜0.01).The expression of Caspase-9 and Caspase-3 began to decline 18 h after the administration with an increasing peak of cleaved Caspase-9 which decreased slightly at 36 h.An obvious cleaved Caspase-3 could also be observed 36 h after thebook=2,ebook=6administration.In the WNK3+IL-1β group,the decline of Caspase-3 was more moderate when comparing with that in the Vector+IL-1β group.A small quantity of cleaved Caspase-3 could be detected and showed an statistical signifi cance in comparison with that of the same group at 0 h (P＜0.05) with the WNK3; the expression of p-JNK declined but t-JNK did not change.Conclusion:IL-1β may decrease activity of HEK293 cells while transfection of WNK3may partly reverse this affection of IL-1β.The over expression of WNK3may inhibit the activation of JNK pathways induced by IL-1β,decrease the activation of Caspase pathway to reduce apoptosis,and fi nally protect the kidney cells under adverse conditions.

Key words:WNK3; JNK; IL-1β; kidney; apoptosis

通信作者：郑雯洁，副主任医师，Email：wzwjzheng@sina.com。

作者简介：王德选（1977-），男，浙江苍南人，主治医师，博士。

基金项目：国家自然科学基金青年基金资助项目（81200513）；钱江人才项目（2011R10049）；温州市科技局科研基金资助项目（H20110014）。

收稿日期：2015-07-10

[中图分类号]S941.42

[文献标志码]A

DOI:10.3969/j.issn.2095-9400.2016.01.001