酶标仪与血小板聚集仪测定血小板抗低渗休克反应的比较分析

甘新宇,杨　洋,赵景岚,于丽君

(成都军区总医院输血科,四川成都 610083)



·临床研究·

酶标仪与血小板聚集仪测定血小板抗低渗休克反应的比较分析

甘新宇,杨洋,赵景岚,于丽君

(成都军区总医院输血科,四川成都 610083)

摘要:目的通过与血小板聚集仪法进行比较，建立用酶标仪测定血小板低渗休克反应(HSR)的方法。方法分别用酶标仪和血小板聚集仪对含不同比例新鲜血小板的富血小板血浆进行HSR检测，并对这两种方法的灵敏度、准确度和重复性进行比较分析。结果酶标仪法和血小板聚集仪法测得HSR分别为(65±24)%和(69±20)%，灵敏度均为20%；采用酶标仪法和血小板聚集仪法对分别含75%、50%、25%球形血小板样品重复测定10次，变异系数(CV)分别为10.3%、5.2%、3.5%和11.0%、6.2%、4.1%；HSR测定值准确度与球形血小板百分比相关,其相关系数r分别为0.959 8和0.968 4。结论酶标仪法与血小板聚集仪法对HSR的测定无明显差异，酶标仪可用于HSR的标准化检测。

关键词:血小板低渗休克反应；酶标仪；血小板聚集仪

血小板低渗休克反应(HSR)是指血小板(PLT)在渗透压低的环境中会发生肿胀变形，一定时间后又可恢复其原有形状，这种变形后又恢复的能力是反映PLT功能的一项重要指标，它与PLT的回收率和存活时间呈正相关[1-2]。目前，国内HSR检测方法尚未标准化，常用方法包括分光光度计检测法和血小板聚集仪检测法[2-3]。本研究利用酶标仪对HSR进行检测，并与血小板聚集仪检测法进行灵敏度、准确度和重复性等方面的对比研究，分析酶标仪法检测HSR的效能。现报道如下。

1材料与方法

1.1样品制备[4]采用血小板单采仪采集1个治疗量的PLT，取10 mL乏血小板血浆(PPP)，加入单采PLT调节PLT浓度至(250～300)×109/L，即富血小板血浆(PRP),将其分为两份：(1)1份PLT悬液放入专用PLT保存箱中静置25 h，再振荡1 h，即为100%的正常PLT；(2)另1份加入2 g/L的乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)后，放入2～4 ℃冰箱储存24 h，取出放入PLT专用保存箱静置1 h，再振荡1 h，即为100%的球形PLT。两份均用羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液调节pH值至7.0后待用。

1.2主要仪器Thermo MK3型酶标仪(天津开元医疗有限公司)，500CA型血小板聚集分析仪(美国Chrono-log公司)，ABX60型血细胞计数仪(日本Sysmex公司)。

1.3方法

1.3.1血小板聚集仪法测定HSR[4]将血小板聚集仪搅拌速度旋钮调至刻度10并开机预热30 min，然后将PPP、PRP、磷酸盐缓冲液(PBS)和蒸馏水4种液体放入预热槽中预热10 min。吸取500 μL PRP和PPP至两个测试杯中，搅拌加有PPP的测试杯后放置到测试位,调节基线至0%～100%，待基线稳定后吸取250 μL PBS加入到PPP中，立即运行30 s，记录PBS的吸光度(A)值(以X表示)；吸取250 μL蒸馏水加入PRP中行相同测试，记录A值，待A值达到平衡后终止测定，记录样品最大A值(以Y表示)和最小A值(以Z表示)。计算HSR=[(Y-Z)/(Y-X)]×100%。

1.3.2酶标仪测定HSR[5]分别取样品3份，同时测定HSR并取测定结果的平均值。(1)测定最小吸光度(A0)和恢复15 min后吸光度(A15)：在96孔酶标板微孔中加入200 μL蒸馏水，再加入样品100 μL，蒸馏水调零，以630 nm波长作为主波长，450 nm波长为第2波长，用MK3型酶标仪测定样品的A0，并于15 min后振荡15 s再次测定该样品的A15。(2)测定最大吸光度(Amax)：在96孔酶标板微孔中加入200 μL PPP，再加入样品100 μL，PPP调零，用MK3型酶标仪以相同波长测定样品的Amax值。(3)HSR的计算：HSR=(A15-A0)/(Amax-A0)×100%。

1.3.5准确性试验[4]按1.3.3同样方法配制0%、25%、50%、75%、100%的球形PLT悬液,同样用酶标仪和聚集仪分别检测HSR，比较球形PLT水平及其与HSR测定值的相关性，以及两种检测方法的相关性。

2结果

2.1两种方法HSR检测结果比较酶标仪法测得HSR为(65±24)%，血小板聚集仪法测得HSR为(69±20)%，差异无统计学意义(t=0.7，P=0.25)。

表1　　两种HSR检测方法的重复性比较(n=10，%)

2.3两种方法检测HSR的灵敏度比较应用两种方法分别检测0%、10%、20%、30%球形PLT悬液,重复10次检测。分别与球形PLT百分比为0%的溶液比较，酶标法在球形PLT百分比为20%、30%时测得的HSR降低，差异有统计学意义(t值分别为2.228、3.169，P<0.05)；血小板聚集仪法在球形PLT百分比为20%、30%时测得的HSR也降低，差异有统计学意义(t值分别为2.764、3.581，P<0.05)。当球形PLT增加到20%时，两种方法测得的HSR均开始明显降低,故两种方法的检测灵敏度均为20%。见表2。

表2　　两种HSR检测方法的灵敏度

*：P<0.05，与同种方法球形PLT百分比为0%的悬液比较。

2.4两种方法检测HSR的准确性及其与PLT水平的相关性用两种方法分别对0%、25%、50%、75%、100%的球形PLT悬液进行HSR检测，测得HSR与球形PLT水平呈明显正相关(酶标仪法：r= 0.959 8；血小板聚集仪法：r= 0.968 4)。两种方法测得25%、50%、75%、100%球形PLT悬液的HSR比较，差异均有统计学意义(t值分别为1.735、1.799、1.703、1.621，P<0.05)，且两种方法测得HSR也呈正相关(r=0.987 5)。见表3。

表3　　两种HSR检测方法的准确性

*：P<0.05，与相同球形PLT百分比悬液血小板聚集仪法测得HSR比较。

3讨论

血小板聚集仪检测原理有比浊法和电阻法两种，电阻法适用于全血和血浆检测，而比浊法仅适用于血浆检测。比浊法实际就是A值检测法，酶标仪的检测原理也是A值检测。在检测血浆中PLT的聚集时，如果能用方便快捷的酶标仪代替血小板聚集仪，将会极大地方便检验人员。

HSR反映了PLT在低渗环境中因水进入发生变形后又恢复其原有正常形态的能力,在PLT悬液中加入水，悬液即处于低渗状态，水渗入PLT,PLT的体积随即发生肿胀，光透射增强；如果PLT功能正常，就能逐出细胞内的水份，其体积又能恢复到正常状态，于是光的折射率增强，A值降低。PLT这一体积膨胀又恢复的变化是由细胞内一系列的复杂活动和细胞膜离子通道变化及外部刺激所引起。与其他动物细胞一样，在低渗环境中，PLT通过产生一系列反应使自身体积肿胀后再恢复正常，这主要是通过降低细胞内各种离子的浓度来维持PLT的体积，通常这种反应通过腺苷三磷酸(ATP)来完成。即在低渗溶液中细胞通过渗透吸水作用使水进入，细胞发生肿胀，此时细胞钙离子(Ca2+)浓度很快下降，Ca2+浓度下降导致细胞ATP的释放，ATP与G-蛋白-磷脂酶C相连接，而后G-蛋白腺苷酸脱氨酶与Ca2+受体连接，导致细胞膜上钾离子(K+)、氯离子(Cl-)通道开启，K+、Cl-同向转移，K+、氢离子(H+)泵关闭。这一系列信号传导导致K+、Cl-和水又从细胞内移出，于是细胞的体积又恢复正常[5-6]。检测HSR就是通过检测PLT体积膨胀时光透射变强，而PLT体积恢复时光透射又变弱，来评价PLT的体外功能，以细胞反应恢复率表示。PLT在低渗环境中体积膨胀到最大时所需时间约为18 s。应用酶标仪测定HSR时，加入PRP后混匀8 s，再放入酶标仪进行吸光度监测，这段时间大约需要10 s；PLT体积从最大恢复到正常所需时间约为15 min，故检测时间设定在15 min。值得注意的是，环境温度对HSR的测定有较大影响，22 ℃保存的PLT悬液在测定前需预温至37 ℃后再行测定。

本研究结果显示，酶标仪和血小板聚集仪两种方法测定HSR无明显差异，与文献[6-10]报道的40%～80%结果比较吻合，说明酶标仪是可以用于测定HSR的。酶标仪是实验室常用仪器，采用酶标仪测定PLT的HSR，其方法简单，所需样品少，重复性完全能达到要求，结果准确，检测迅速，可同时测定多份样品。对于没有血小板聚集仪的实验室，可以选择用酶标仪进行HSR检测。

参考文献

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(收稿日期：2015-10-06)·临床研究·

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.05.041

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)05-0670-03