宫颈癌患者外周血CD4+CD25+调节性T淋巴细胞与白细胞介素-17水平及其相关性研究

周勇军，李龙平，王新华

(益阳市中心医院检验科，湖南益阳 413000)



·临床研究·

宫颈癌患者外周血CD4+CD25+调节性T淋巴细胞与白细胞介素-17水平及其相关性研究

周勇军，李龙平，王新华

(益阳市中心医院检验科，湖南益阳 413000)

摘要:目的探讨外周血CD4+CD25+调节性T淋巴细胞(Tr细胞)和白细胞介素-17(IL-17)水平在宫颈癌患者中的变化及其相关性。方法选取2014年1月至2015年3月该院确诊宫颈癌患者60例(宫颈癌组)和查体的健康女性60例(健康对照组)，采用流式细胞仪检测外周血Tr细胞数量及占CD4+细胞百分比，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清IL-17水平。结果宫颈癌组外周血Foxp3+Tr、Tr、CD4+T淋巴细胞百分比，Foxp3+Tr/Tr、Tr/ CD4+T淋巴细胞比值及血清IL-17水平均较健康对照组明显升高，而IL-17/Tr比值明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。宫颈癌组患者外周血CD4+CD25+Tr细胞水平与血清IL-17水平呈正相关(r=0.768，P<0.05)。结论宫颈癌患者存在细胞免疫功能紊乱，IL-17与Tr细胞比值失衡可能在宫颈癌发病机制中起一定的作用。

关键词:宫颈癌；CD4+CD25+调节性T淋巴细胞；白细胞介素-17

宫颈癌是妇科常见的生殖系统恶性肿瘤之一，其发病率仅次于乳腺癌。越来越多的研究表明，肿瘤的发生、发展与肿瘤免疫逃逸密切相关，CD4+CD25+调节性T淋巴细胞(Tr细胞)是一种新型免疫抑制细胞，能维持自身耐受和免疫稳定，同时抑制免疫系统对肿瘤的免疫应答，其独特的免疫抑制作用可能在肿瘤免疫逃逸中起了“主干”作用[1]。有研究表明，宫颈癌患者体内存在CD4+CD25+Tr细胞比例失调，肿瘤负荷与宫颈癌患者体内CD4+CD25+Tr细胞水平有关，提示CD4+CD25+Tr细胞表达异常参与了宫颈癌的发生、发展[2]。炎症和肿瘤之间可能存在一定的关系，慢性感染和炎症能介导一系列炎性介质(如细胞因子、酶、趋化因子等)一起造成炎症微环境，被认为是宫颈癌发生、发展的重要原因之一。白细胞介素-17(IL-17)是辅助性T淋巴细胞17(Th17)分泌的前炎性细胞因子，作为细胞核心的炎性因子具有强有力的诱导能力，可促进细胞增殖和血管生成，从而发挥促进慢性炎症和肿瘤生长的作用[3]。本研究通过检测60例，宫颈癌患者外周血中CD4+CD25+Tr细胞及IL-17水平的表达，旨在进一步探讨IL-17和CD4+CD25+Tr细胞在宫颈癌发生、发展中的作用及其发病机制，为宫颈癌的临床免疫调节治疗提供一定的理论依据。

1资料与方法

1.1一般资料2014年1月至2015年3月本院妇科收治的经临床妇科检查诊断和活检后病理确诊的初次就诊宫颈癌患者60例，纳入宫颈癌组，年龄32～79岁，平均(40.57±15.62)岁，所有患者无其他系统恶性肿瘤及转移性肿瘤，未经放、化疗治疗及内分泌治疗和免疫治疗，取材前3 d内无阴道冲洗及阴道用药史。另选取本院查体的健康女性60例作为健康对照组，年龄26～75岁，平均(38.73±12.23)岁，均有性生活史，均为非妊娠状态，均无子宫切除和宫颈手术史，均排除近期感染和自身免疫病史，均未使用糖皮质激素和非甾体类药物。所有标本的收集均经患者或其家属同意，签署知情同意书。两组年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具可比性。

1.2仪器与试剂荧光素标记的单克隆抗体：异硫氰酸荧光素标记CD4(CD4-FITC)、藻红蛋白标记CD25(CD25-PE)、异硫氰酸荧光素标记IgGI(IgGI-F1TC)和藻红蛋白标记IgGI(IgGI-PE)均购自美国BD公司；淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品有限公司；酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒购自美国Linco公司。Beckman Coulter EP-ICS XL流式细胞仪购自美国Beckman Coulter公司。

1.3方法

1.3.1外周血CD4+CD25+Foxp3+Tr细胞检测取健康女性查体当日和患者入院第2天清晨静脉新鲜血液5 mL，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，以淋巴细胞分离液得淋巴细胞，取分离的T淋巴细胞悬液100 μL，分别加入抗CD4-FITC、抗CD25-PE的单克隆抗体各20 μL，同型对照分别为IgGI-F1TC、IgGI-PE，混匀，避光孵育25～30 min。1 500 r/min离心5 min，弃上清。加入2 mL磷酸盐缓冲液(PBS)混匀，1 000 r/min离心5 min，弃上清。将细胞悬浮于0.5 mL PBS中，振荡混匀后待测。应用流式细胞仪检测宫颈癌组和健康对照组外周血单个核细胞(PBMC)中CD4+CD25+Foxp3+Tr细胞。

1.3.2IL-17检测所有受试者清晨空腹抽取静脉血5 mL，3 000 r/min离心5 min，血清分离后放-20 ℃冰箱保存备用。采用ELISA试剂盒测定血清IL-17水平，严格按试剂说明书进行测定。

2结果

2.1两组外周血Tr细胞及血清IL-17水平比较宫颈癌组外周血Foxp3+Tr、Tr、CD4+T淋巴细胞百分比及Foxp3+Tr/Tr、Tr/ CD4+T淋巴细胞比值及血清IL-17水平均较健康对照组明显升高，而IL-17/Tr比值明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1　　两组外周血Tr细胞及血清IL-17水平比较±s)

2.2宫颈癌组外周血Tr细胞表达与血清IL-17水平的相关性分析将Tr细胞表达水平与血清IL-17水平进行相关性分析，宫颈癌组患者血清IL-17水平越高，外周血CD4+CD25+Tr细胞表达水平越高，二者呈正相关(r=0.768，P<0.05)。

3讨论

宫颈癌是发生在宫颈鳞状上皮细胞和宫颈管内膜柱状上皮细胞交界处的最常见的恶性肿瘤之一，其发病率有明显上升趋势，发病年龄呈现年轻化趋势。相关研究显示，宫颈癌的发生、发展是多因素共同作用导致的，经常规肿瘤细胞减灭术及化疗得以有效缓解，但依然有相当一部分患者存在复发和远处转移的可能，从而影响卵巢癌的治疗疗效与预后，其中肿瘤免疫逃逸起“关键”作用，肿瘤在发生、发展过程中演化出逃避免疫监视的方式，导致宿主不能有效清除肿瘤。近年来的研究表明，CD4+CD25+Tr细胞是一群具有免疫抑制功能的T淋巴细胞亚群，其主要通过细胞与细胞接触、细胞溶解、竞争性抑制、分泌抑制性细胞因子、间接抑制等方式发挥作用，在维持机体免疫稳定、调控免疫应答方面起重要作用，Tr细胞的免疫无能和免疫抑制使得肿瘤免疫逃逸，可能是肿瘤免疫逃逸中的关键因素[4-5]。近年来研究表明，肝癌、乳腺癌、胃癌等多种癌症患者外周循环血中均发现Tr细胞增多，Tr细胞可通过抑制体内的T淋巴细胞活化从而抑制抗肿瘤免疫反应，在维持肿瘤免疫耐受中发挥重要作用，Tr细胞与肿瘤进展及不良预后密切相关[6]。Foxp3表面分子是叉头翼状螺旋转录因子的总称，特异性表达在Tr细胞上，是Tr细胞的一个特异性标志，Tr细胞活化可导致其表达Foxp3增加，Foxp3表达在Tr细胞的发育和功能上起重要作用[7]。IL-17是近年来发现的一种促炎细胞因子，是由活化的人CD4+T淋巴细胞产生的重要细胞因子，作为一种独特的多效性细胞因子，晚期肿瘤患者的外周血及肿瘤组织中均可查见分泌IL-17的细胞，IL-17能促进细胞增殖，并发挥着促进新生血管生成的作用，通过促进血管生成及肿瘤细胞的增殖，参与肿瘤的发生与发展。虽然，目前已经有大量的研究证实Tr细胞能够抑制T淋巴细胞的免疫应答，导致肿瘤细胞的免疫逃逸，但是关于宫颈癌患者Tr细胞与IL-17表达水平的变化及两者相互作用关系的研究报道较少。本研究通过检测宫颈癌患者Tr细胞与血清IL-17表达水平的变化，深入研究宫颈癌患者的免疫抑制机制，以期为宫颈癌患者寻找高效的免疫治疗方案提供一定的理论依据。

本研究发现，宫颈癌组患者外周血Foxp3+Tr、Tr、CD4+细胞百分比，Foxp3+Tr/Tr、Tr/ CD4+T比值，以及血清IL-17水平均较健康对照组明显升高，而IL-17/Tr明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。宫颈癌患者外周血中CD4+CD25+Tr细胞数量升高可以反映肿瘤患者免疫系统存在抑制状态，由此可能导致机体自身有效的免疫抑制功能增强，减弱了免疫监视作用，在肿瘤的逃逸机制中发挥作用，可以保护肿瘤细胞，提示宫颈癌的发生与机体免疫状态密切相关，尤其是T淋巴细胞介导的免疫反应，宫颈癌机体处于一种潜在的免疫抑制状态[8]。有研究发现，IL-17基因低甲基化导致IL-17高表达，IL-17能诱导肿瘤特异性杀伤性T淋巴细胞的活性及功能增强，同时诱导抗肿瘤保护性免疫应答的形成，从而发挥其抗肿瘤活性[9]。宫颈癌患者外周血Foxp3+Tr细胞与Tr细胞的比值较对照组明显升高，表明Foxp3+Tr在宫颈癌细胞免疫逃逸中发挥着重要作用，对宫颈癌的发生、发展起重要推动作用。有研究发现，FoxP3表达在宫颈癌组织中增高，并与P16INK4a(人乳头瘤病毒整合到宿主细胞的关键标志)表达相关，与肿瘤大小呈正相关，表明FoxP3在宫颈癌的发生中发挥重要作用[10]，与本研究相符。有研究表明，FoxP3+Tr介导的宫颈癌免疫逃逸与前列腺素E2(PGE2)密切相关，PGE2能诱导白细胞介素-10(IL-10)的产生并抑制白细胞介素-12(IL-12)的产生，IL-10具有免疫抑制功能，而IL-12具有增强机体抗肿瘤免疫效应功能，从而打破了免疫抑制与免疫效应之间的平衡，使机体的免疫监视功能下降，提示FoxP3的功能性高表达可能为导致宫颈癌发病的原因之一[11]。相关性分析结果表明，IL-17表达水平与CCD4+CD25+Tr细胞表达水平呈正相关，IL-17水平越高，CD4+CD25+Tr细胞表达水平越高，表明血清IL-17在宫颈癌发病机制上发挥重要作用。Th17的主要效应因子是IL-17，IL-17细胞和Tr细胞之间存在着反向分化的机制，Tr细胞的表达较IL-17细胞的表达升高更明显，呈现优势表达，导致了IL-17/Tr比值呈下降趋势，说明在宫颈癌患者中这种免疫平衡状态被打破，导致了Th17细胞和Tr细胞表达水平升高，并且随着肿瘤的发展而逐渐升高，这可能是宫颈癌发生的机制之一[12-13]。

综上所述，CD4+CD25+Tr细胞和IL-17水平的升高可能参与了宫颈癌的发生、发展，机体的免疫调节功能异常加剧IL-17/Tr失衡，从而导致宫颈癌的发生，在外周血中的水平可能成为监测患者体内细胞免疫状态和机体抗肿瘤免疫应答的指标，在疾病的诊断、预后和肿瘤免疫治疗中有很好的应用前景。

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(收稿日期：2015-09-20)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.05.049

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)05-0685-03