血红素加氧酶- 1对急性肝衰竭大鼠肝组织HMGB1及炎症的影响

张志恒，李俊生，施晓雷

(1.东南大学 医学院，江苏 南京　210009； 2.南京鼓楼医院 普外科，江苏 南京　210008)



血红素加氧酶- 1对急性肝衰竭大鼠肝组织HMGB1及炎症的影响

张志恒1，李俊生1，施晓雷2

(1.东南大学 医学院，江苏 南京210009； 2.南京鼓楼医院 普外科，江苏 南京210008)

[摘要]目的：探索血晶素(hemin)诱导血红素加氧酶- 1(HO- 1)过表达对急性肝衰竭(急性肝衰)大鼠肝脏中高迁移率族蛋白B1(HMGB1)及相关炎症因子的影响。方法：将96只SD大鼠按给药方法不同分成4组，即对照组、急性肝衰、hemin(HO- 1诱导剂)组、锌原卟啉(znpp，HO- 1抑制剂)组，每组24只。对照组腹腔注射生理盐水；急性肝衰组腹腔注射D- Gal 0.8 g·kg(-1)及LPS 20 μg·kg(-1)制作肝衰竭模型；hemin、znpp组腹腔分别注射hemin 40 μmol·kg(-1)或znpp 50 μmol·kg(-1)，12 h后给予D- Gal和LPS，方法同急性肝衰组。检测各组大鼠诱导后24、 72 h肝脏功能变化，比较4组大鼠肝脏组织病理学表现。应用RT- PCR及Western Blot检测肝组织中HO- 1、HMGB1水平，ELISA检测TNF- α及IL- 1β浓度；检测HO- 1活性。结果：采用D- Gal和LPS成功建立了大鼠急性肝衰竭模型，与对照组比较，急性肝衰组谷氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、IL1β、TNF- α浓度及HMGB1水平均升高(P<0.05)，肝脏组织损伤严重。与急性肝衰组比较：hemin组HO- 1水平及活性上调，ALT、AST、IL1β、TNF- α浓度(P<0.05)及HMGB1水平显著降低，肝脏组织损伤缓解；而znpp组HO- 1水平及活性降低， ALT、AST、IL1β、TNF- α浓度(P<0.05)及HMGB1水平升高，肝脏组织损伤加重。结论：在急性肝衰竭中HMGB1明显增加，HO- 1的过表达可以缓解急性肝衰竭肝脏损伤，其机制与抑制HMGB1、IL1β、TNF- α的表达有关。

[关键词]高迁移率族蛋白B1； 急性肝衰竭； 血红素加氧酶- 1； 炎症

急性肝衰竭(acute liver failure， ALF)是一种以短期肝功能快速丢失为特征的临床重症，其预后差、死亡率高[1]。近年研究表明，炎症因子及高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein 1， HMGB1)在肝脏急、慢性疾病的不良转归中扮演重要角色[2]。损伤的肝脏细胞产生HMGB1，激活巨噬细胞相关的免疫反应，产生大量活性介质及炎症因子，进而加重损伤器官中内环境的紊乱导致细胞死亡[3]。

血红素加氧酶- 1(heme oxygenase- 1， HO- 1)是体内广泛存在的一种可诱导酶。研究表明：其具有抗炎、抗氧化应激、抗凋亡的细胞保护作用[4]；在肾脏、肝脏、心脏及小肠损伤的模型中，HO- 1直接或间接发挥了保护作用，减轻了器官的损伤，其机制主要为抑制炎症反应及细胞的凋亡[4- 7]；此外在酒精性肝损伤中，使用HO- 1诱导剂血晶素(hemin)或一氧化碳治疗后，大鼠肝细胞的凋亡和氧化应激得到极大的抑制[8]。据此，本研究对ALF大鼠HO- 1的表达进行干预，观察其对急性肝衰竭大鼠肝脏中HMGB1及炎症因子的影响。

1材料与方法

1.1动物与主要试剂

SD雄性大鼠，体重210～240 g，鼠龄7～9周，购于南京鼓楼医院动物实验中心。D- Gal、LPS、hemin和锌原卟啉(znpp，HO- 1抑制剂)及ELISA试剂盒购于Sigma公司，抗大鼠HO- 1、actin及HMGB1抗体购于Abcam公司，HO- 1活性试剂盒购于南京建成科技有限公司，总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒购于Invitrogen公司，SYBR GreenTaq购于日本TaKaRa公司，引物委托南京威灵生物有限公司设计合成。

1.2实验方法

1.2.1模型分组与处理将96只大鼠按照给药方法分为4组，每组24只。(1)对照组：腹腔注射等量生理盐水；(2)ALF组：取D- Gal (0.8 g·kg-1)和LPS (20 μg·kg-1)给SD大鼠腹腔注射构建ALF模型；(3)hemin组：ALF造模前12 h腹腔注射hemin(40 μmol·kg-1);(4)znpp组：ALF造模前12 h腹腔注射znpp(50 μmol·kg-1)；在诱导ALF后24、72 h尾静脉取血，检测肝功能及炎症因子，取肝组织行病理学检查。

1.2.2HO- 1及HMGB1 mRNA表达检测实时定量PCR法检测HO- 1、HMGB1 mRNA；采用TRIzol法提取总

RNA。反应条件为95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃

延伸12 s；HO- 1上游引物:5- ACCCCACCAAGTTCAAA

CAG- 3；HO- 1下游引物: 5- GAGCAGGAAGGCGGTCTT

AG- 3；HMGB1上游引物：5- CTGGCTTATCCATTGGTGA

TGT- 3； HMGB1下游引物：3- CCTTTAGCTCTGTAGGC

AGCAA- 5；β- actin 上游引物: 5- GCGCTCGTCGTCGAC

AACGG- 3；β- actin 下游引物:5- GTGTGGTGCCAAATCT

TCTCC- 3； 检测HO- 1、HMGB1基因的表达量，用β- actin为参照物，结果用2-△△Ct表示。

1.2.3HO- 1活性测定取肝组织置于液氮半小时后冻存于-80 ℃，使用试剂盒检测HO- 1活性，操作方法严格按照其说明书进行。

1.2.4Western blot检测肝组织HO- 1及HMGB1蛋白取大鼠肝脏制备蛋白样品，加入SDS- PAGE凝胶电泳缓慢分离后转膜60 min至PVDF膜。5%BSA室温封闭2 h，加入HO- 1或HMGB1抗体(1︰1 000)，置4 ℃过夜。TBST洗5遍，置于ECL试剂A和试剂B中孵育5 min，X线片曝光，使用Image J软件对条带进行分析。

1.2.5血清TNF-α、IL- 1β及肝功能检测血清中TNF-α及IL- 1β浓度使用ELISA试剂盒检验，操作方法严格按照说明书进行；用AU 2700全自动生化仪检测肝功能。

1.2.6肝脏病理组织学观察取新鲜肝脏组织固定于10%福尔马林液，常规石蜡包埋，制作5 μm厚切片，使用苏木精- 伊红(HE)染色后光镜下观察各组肝组织病理学变化。

1.3统计学处理

2结果

2.1各组肝功能比较

与对照组比较，ALF组谷氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)升高(P<0.05)。与ALF组比较， hemin组ALT、AST明显下降(P<0.05)；而znpp组ALT、AST显著升高(P<0.05)。见表1。

U·L-1

与对照组比较，aP<0.05； 与ALF组比较，bP<0.05

2.2各组肝脏病理学观察

对照组肝脏结构基本无异常，炎症反应轻微。ALF组可见组织坏死，肝板解离，肝窦正常结构消失，淋巴细胞、中性粒细胞浸润。与ALF组比较，hemin组肝脏损伤程度明显缓解，炎性细胞浸润减少；而znpp组肝脏结构破坏更加严重，伴随单核细胞及淋巴细胞浸润。见图1。

图1各组肝脏组织病理学结构HE染色×200

2.3各组肝内HO- 1及HMGB1 mRNA、蛋白水平和HO- 1蛋白活性检测

与对照组比较，ALF组HO- 1、HMGB1 mRNA和蛋白水平升高(P<0.05)。与ALF组比较，hemin组HO- 1 mRNA、蛋白水平及HO- 1活性均显著升高(P<0.05)，HMGB1 mRNA和蛋白水平显著降低(P<0.05)；而znpp组HO- 1 mRNA和蛋白水平显著降低，HO- 1活性、HMGB1水平显著升高(P<0.05)。见图2。

与对照组比较，aP<0.05； 与ALF组比较，bP<0.05

A.HO- 1 mRNA表达量； B.HO- 1活性； C.HMGB1 mRNA表达量； D.HO- 1和HMGB1蛋白表达量

2.4各组血清中炎症因子水平变化见表2。

ng·L-1

与对照组比较，aP<0.05； 与ALF比较，bP<0.05

与对照组比较，ALF组血清中TNF-α和IL- 1β的浓度均升高(P<0.05)。与ALF组比较，hemin组TNF-α和IL- 1β的浓度均下降(P<0.05)；而znpp组TNF-α和IL- 1β浓度出现了轻微上升(P<0.05)。

3讨论

急性肝衰竭是一种以快速和严重的肝细胞损伤为特征伴随着全身炎症反应的临床重症[1，9]。固有免疫系统的激活是ALF早期的重要特征之一，其中Kupffer细胞(KCs)是肝脏固有免疫系统的主要成分之一。Yan 等[10]的研究表明，在ALF的起始阶段KCs呈爆发性的增殖、活化，同时产生的炎症因子(如TNF-α和 IL- 1β)对肝脏进行二次损伤。HMGB1是激活KCs的重要介质之一，KCs细胞激活后同样能释放大量HMGB1，最终形成一个恶性循环。然而，Antoniades等[11]的研究证明，在ALF的后期KCs的促炎活性受到抑制，肝脏功能不断恢复，说明通过调节KCs可能是干预ALF的潜在方向之一，HMGB1作为KCs功能的重要参与者需要深入观察研究。

当组织损伤时，HMGB1可由损伤或坏死的细胞及活化的免疫细胞释放至外周环境中，通过激活TLR4或Rage受体，继而活化NF-κB通路释放大量促炎因子，同时趋化中性粒细胞至损伤部位，最终加重局部组织的损伤[3，12- 13]；说明HMGB1水平的升高与不良结局相关。本实验中使用LPS/D- Gal诱导ALF后，与对照组比较，ALF组肝脏组织出现大量坏死和免疫细胞浸润，HMGB1水平、血清TNF-α和 IL- 1β的浓度均升高；因此，HMGB1是在ALF中有着重要的地位，通过调节HMGB1水平可能是干预ALF的潜在方向之一。

HO是维持细胞内稳定的重要蛋白，广泛存在于细胞内，有3种同分异构体，即HO- 1、HO- 2和HO- 3，其中多种情况可以诱导HO- 1产生，具有抗炎、抗氧化和免疫调节的功能[14]； HO- 1通过抑制炎症小体的形成，进而抑制 NF-κB 通路的激活，使其下游的IL- 1β浓度下降，最终保护内皮的功能[15]；在胎盘组织中，HO- 1可以通过扩张血管促进胎盘血流灌注，对胎儿起保护作用[16]；Tao等[17]同样发现，HO- 1可以通过抗炎、抗凋亡及促进肝细胞增殖，继而缓解ALF。以上研究说明，HO- 1在炎性疾病中具有保护作用。我们的实验发现，ALF组中HO- 1水平出现升高，证实HO- 1可以在损伤的组织内升高，这可能是细胞的一种自我保护机制[18]；当使用hemin诱导HO- 1后，大鼠ALT、AST出现明显下降，病理学显示HO- 1缓解了肝脏炎症细胞浸润及肝细胞的坏死，同样HMGB1的水平也被HO- 1抑制，外周血TNF-α和 IL- 1β浓度也出现下降。但是，当使用HO- 1抑制剂znpp后，大鼠的HMGB1水平及转氨酶、TNF-α、IL- 1β浓度相对于ALF组都出现了轻度的回升。

综上所述,hemin可以减轻D- Gal/LPS诱导的大鼠ALF，其机制为上调HO- 1水平及其活性，进而抑制HMGB1、IL1β、TNF-α的表达。

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Effects of HO- 1 on the expression of HMGB1 and inflammatory cytokines in rats with acute liver failure

ZHANG Zhi- heng1，LI Jun- sheng1，SHI Xiao- lei2

(1.SchoolofMedicine，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China;2.DepartmentofGeneralSurgery，NanjingDrumTowerHospital，Nanjing210008，China)

[Abstract]Objective： To investigate the effects of upregulation of heme oxygenase- 1 with hemin on the expression of liver HMGB1 and associated inflammatory cytokines in rats during acute liver failure. Methods: Ninety six SD rats were divided into 4 groups (n=24) according to the processing conditions: control group， acute liver failure(ALF) group， hemin(HO- 1 inducer) group， znpp(HO- 1 inhibitor) group. Acute liver failure model was induced by intraperitoneally injection of D- Gal (0.8 g·kg(-1))and LPS (20 μg·kg(-1))， control group was given the same volume of saline. Hemin (40 μmol·kg(-1) ) or znpp (50 μmol·kg(-1)) was given intraperitoneally starting from 12 hours before D- Gal and LPS administration. The level of ALT and AST were detected at 24， 72 h after injection and the liver histopathological sections were compared. RT- PCR and Western blot were used to calculate the mRNA and protein levels of HO- 1 or HMGB1 in liver. Serum IL1β and TNF- α concentration were measured by ELISA. HO- 1 activity was detected. ALF model were successfully induced. Results: ALF model were successfully induced by intraperitoneal injection of D- Gal and LPS. Compared with control group， the levels of ALT， AST， IL1β，TNF- α and HMGB1 in ALF group increased significantly(P<0.05)， the structure of liver was damaged severely. Compared with ALF group， hemin treatment markedly increased the levels of HO- 1 and HO- 1 activity which inhibited the levels of ALT， AST， IL1β，TNF- α and HMGB1(P<0.05); While znpp treatment inhibited the levels of HO- 1 and HO- 1 activity thus leading to the up regulation of ALT， AST， IL1β、TNF- α and HMGB1(P<0.05) which aggravated liver damage. Conclusion: The level of HMGB1 is in accordance with the severity of ALF. HO- 1 over- expression could ameliorate the damage of liver. Down- regulated HMGB1， IL1β and TNF- α might be its potential mechanism．

[Key words]high mobility group protein B1; acute liver failure; heme oxygenase- 1; inflammation

doi：10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.02.002

[中图分类号]R459.7

[文献标识码]A

[文章编号]1671- 6264(2016)02- 0171- 05

[通信作者]施晓雷E- mail：njsxl2000@163.com; 李俊生E- mail:Lijunshenghd@126.com

[作者简介]张志恒(1991-)，男，江西抚州人，在读硕士研究生，E- mail:zhangzhihengfly@163.com

[基金项目]国家自然科学基金(81170418)；江苏省自然科学基金(BK20131084)；江苏省普通高校研究生实践创新计划项目基金(SJLX15- 0078)资助项目

[收稿日期]2015- 11- 06[修回日期] 2016- 01- 04

[引文格式] 张志恒，李俊生，施晓雷.血红素加氧酶- 1对急性肝衰竭大鼠肝组织HMGB1及炎症的影响[J].东南大学学报:医学版，2016，35(2)：171- 175.

·论著·