探析三七中三七素及其异构体的高效液相色谱检测

冯伟旭

哈药集团世一堂制药厂 150000

探析三七中三七素及其异构体的高效液相色谱检测

冯伟旭

哈药集团世一堂制药厂 150000

目的：采用 2，4-二硝基氟苯为柱前衍生试剂，建立测定三七中三七素(β-ODAP)及其异构体(α-ODAP)的柱前衍生反相高效液相色谱法。方法：采用Luna-C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相为乙腈∶HAc-NaAc(17∶83)；检测波长360nm；柱温40℃；进样量 20μL。结果：三七素(β-ODAP)色谱峰的峰面积与其浓度在 0.30～50.50μg/mL范围内呈良好的线性关系，回归方程为A1=140.50C1+72.30，r1=0.9995；三七素构体(α-ODAP)色谱峰的峰面积与其浓度在0.10～16.15μg/mL范围内呈现良好的线性关系，回归方程为 A2=106.60C2+56.00，r2=0.9992。结论：不同三七样品中均存在检出的三七素(β-ODAP)及其异构体(α-ODAP)。该方法操作简便、快速、准确，选择性好，可用于植物、药物及食品中三七素及其异构体含量的测定。

三七素；2，4-二硝基氟苯；柱前衍生；HPLC

在对我国中药三七进行深入研究中，发现其自身具备止血治疗效果的主要成分在于三七素，这种成分的在化学上是一种非蛋白游离氨基酸。也就是说三七素这种氨基酸并不能组成人体需要的蛋白质。尽管这种物质叫做你三七素，但是并不代表这种物质只存在于三七这种中草药中，在医学实践研究中，发现人参、猪屎豆和苏铁等草药中也含有三七素的成分。另外在对三七素进行深入研究中，发现其在对患者进行止血治疗的过程中还存在一定毒副作用。以下就针对于三七素自身毒副作用和临床药效进行深入研究。

一、仪器与材料

（一）仪器

高效液相色谱仪(Agilent1100)；Luna-C18色谱柱(250mm× 4.6mm，5μm)。

（二）材料

ODAP对照品(兰州大学生物实验室分离提纯，于NaHCO3溶液中保存)；2，4二硝基氟苯(分析纯，某市生工生物，乙腈配成10.0mg/mL的溶液)；磷酸盐缓冲溶液(pH6.9)；HAc-NaAc缓冲溶液(pH4.5)；乙腈(色谱纯，某市科密欧化学试剂有限公司)。实验用三七幼苗为采自云南文山生长 15d的三七幼苗(本实验室蛭石萌发后用文山当地土壤移栽)，实验用三七块根、须根购自云南文山，经天水师范学院王廷璞教授鉴定为五加科植物三七的幼苗、块根与须根。

二、方法与结果

（一）色谱条件

色谱柱：Luna-C18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈∶HAc-NaAc缓冲溶液(17∶83)；柱温：40℃；检测波长：360nm；流速：1.0mL/min；进样量：20μL。

（二）三七素的衍生化反应

准确吸取一定量ODAP对照品储备液(NaHCO3溶液配置)，加入一定体积的FDNB溶液(15倍质量比于三七素)，于60℃恒温水浴锅中衍生反应30min，取出，冷却至室温，用移液器准确移取一定体积的对照品衍生溶液，以磷酸盐缓冲溶液定容至1mL，配制0.40～1.2×103μg/mL9个系列对照品溶液，用0.45μm微孔滤膜过滤后待用。

（三）三七样品溶液的制备

准确称取三七幼苗的不同新鲜组织(叶、茎、根)、干燥块根粉和须根粉各1g(每个样品平行3份)，置于-20℃冰箱冷冻保存，用事先在-20℃冰箱中冷冻过的研钵进行研磨。准确加入30%乙醇7mL作为抽提液，研至匀浆后，静置3min，取上清液1.50mL置离心管中于-4℃下冷冻离心15min(15000r/min)，精密移取1mL上清液置于离心管中，于60℃恒温真空干燥，待样品完全烘干后，向样品中加入100μLNaHCO3溶液，充分震荡，使其溶解，再加入100μLFDNB溶液，于60℃恒温水浴锅中进行衍生反应，30min后取出，冷却至室温，加入 800μL磷酸盐缓冲溶液，以0.5mol/LNaHCO3溶液定容至1mL，用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液进行测定。

（四）线性范围和回归方程

在选定的色谱条件下，β-ODAP色谱峰的峰面积与其浓度在 0.30～50.50μg/mL范围内呈良好的线性关系，回归方程为A1=140.50C1+72.30，r1=0.9995；α-ODAP色谱峰的峰面积与其浓度在 0.10～16.15μg/mL范围内呈良好的线性关系，回归方程为A2=106.60C2+56.00，r2=0.9992。

（五）稳定性试验

将三七块根样品的衍生溶液置于室温保存，分别于衍生结束后的 0、2、4、6、8、12、16、20、24h进行测定，吸收峰面积的RSD为1.3%，表明样品溶液24h内稳定。将75.00μg/mLODAP对照品的衍生溶液置室温下放置7d后进行液相色谱测定，吸收峰峰面积与衍生刚结束无显著性差异。

（六）精密度和准确度试验

对75.00μg/mLODAP对照品衍生溶液连续测量11次，保留时间的相对标准偏差为0.8%，峰面积的相对标准偏差为1.5%；平均加样回收率为98.8%。

（七）样品测定

在选定的色谱条件下，对不同三七样品中的β-ODAP和α -ODAP进行测定，结果见表1。

表1 不同三七样品中β-ODAP和α-ODAP的含量(%，n=3)

三、讨论

要想保证整个实验过程能够全部落实，还需要保证在实验过程中采取的实验试剂能够符合三七素自身结构状态。在这个过程中还需要保证三七素分离度能够达到相应要求。但是在实验研究中了解到采用β-ODAP和α-ODAP这两种分离液进行三七素分离过程还存在一定偏差，这就需要采用Gaussian09方法来计算这两者之间的异构体模式，并选取在不同衍生剂条件下的最低能量结构。在整个色谱柱分析过程中了解到采用β-ODAP和α -ODAP这两种分离剂进行分离得到的三七素在结构上还存在很大的差异，而且这种差异还会因为其在碳柱上停留的时间发生正向比例变化，也就是说在碳柱上停留的时间越长就会导致这两者之间的差异越大，加大了三七素分离的难度。

另外在整个过程中三七素和相应试剂所处的条件也会影响三七素自身衍生效果。一般来说在进行三七素衍生结果分析的时候应该保持衍生温度在30℃-60℃之间，这是因为在超过 60℃的条件下会导致整个三七素衍生过程中的衍生物质明显降低，其根本原因在于这个时间段内三七素自身状况还没有达到稳定的状态下，很容易发生水解现象。在将发生水解之后的三七素移至常温下进行实验操作，发现衍生产物自身吸收峰的面积没有太大的变化，这就说明在三七素在常温下的稳定性是最强的。在对不同的衍生条件进行研究中了解到在整个实验中采取不同的衍生条件对整个实验结果都会产生一定影响。因此在进行衍生条件选取的时候，需要对整个三七素的结构成分有一个全面了解，促使整个衍生实验更加顺利的进行。

在整个实验过程中还需要对色谱条件进行合理优化，在使用乙腈-醋酸盐缓冲溶液的时候会使得整个溶液状态发生严重变化，形成色谱差，造成进行实验的溶剂瓶自身发生非常严重的堵塞现象，针对于这种情况就需要采用乙腈与HAc-NaAc缓冲液结合的方式进行色谱条件优化，保证数据的真实性和有效性。

在上述实验中了解到在不同三七样品中都有三七素的存在，但是这些三七素在结构上还存在一定差异。而且现行实验研究方法还存在很大不足，针对于这种情况就需要在进行三七素研究中对方法中的不足提出有效解决措施。在检测实验中还需要按照三七素的相应物质成分选取有效的缓冲溶液对三七素这种物质进行缓冲，保证其自身反向柱相容性能够符合相应规定。在整个实验中采用的乙腈-醋酸盐溶液对于延长实验色谱柱的使用寿命期到非常重要的作用。另外为了保证三七素分析数据的精准性有一定提升，还需要对整个过程中使用的乙腈-醋酸盐浓度和可溶性有一个全面考虑，保证其自身状态能够全面符合整个实验的需求。一般来说对乙腈-醋酸盐的比例应该保持其能够在10分钟内重复进样，这样对于减少三七素分析时间，提高分析效率起到非常重要的作用。

[1]周桂友，侯艳芳，董新吉.柱前衍生-反相高效液相色谱法测定氨基酸[J]．理化检验(化学分册)，2011，47(8):889-893.

[2]常艳.新药生殖发育毒性评价及胚胎毒性体外筛检方法的建立和应用[D]．上海:上海医药工业研究院，2005.

[3]张勇.三七素临床前药物动力学和雷贝拉唑制剂生物等效性研究[D]．沈阳:沈阳药科大学，2006.

R284.1

A

1672-5018（2016）10-007-02