纳米金比色法测定多西环素和土霉素

曲　黎，魏燕丽，范淑敏

(河南科技学院 新科学院,河南 新乡 453003)



纳米金比色法测定多西环素和土霉素

曲黎，魏燕丽，范淑敏*

(河南科技学院 新科学院,河南 新乡 453003)

摘要：采用柠檬酸钠还原法合成粒径约13 nm的纳米金粒子. 采用紫外-可见分光光度计、荧光分光光度计研究了纳米金粒子与多西环素/土霉素分子的相互作用；通过改变缓冲溶液、纳米金粒子用量、反应时间确定了比色法测定的最优反应条件. 结果表明：在弱酸溶液中，多西环素/土霉素分子中的氨基官能团(-NH2)得到电子成为带电基团(-NH3+) 并通过静电引力与纳米金粒子结合，使得纳米金粒子发生聚集，导致纳米金吸收光谱发生红移和展宽，颜色由酒红色变成蓝色；在盐酸-柠檬酸钠的缓冲溶液中加入2 mL纳米金，反应时间为10 min的条件下测得多西环素和土霉素的线性范围分别为0.06～0.66 mg·L(-1)和0.59～8.85 mg·L(-1)，检出限(3σ)分别为0.008 6、0.083 8 mg·L(-1). 该方法前处理简单、灵敏、可靠，有望应用于食品分析和临床分析等领域.

关键词：纳米金粒子；比色法；多西环素；土霉素

四环素类抗生素(tetracycline antibiotics)是含有并四苯基本骨架的一类广谱抗生素[1-3]. 土霉素和多西环素都可以促进畜禽的生长，预防和治疗畜禽、鱼类的疾病，并可以增加产奶量. 过量使用土霉素和多西环素造成动物产品中药物残留，影响人体健康，因此对动物源性食品中土霉素和多西环素的最高残留，各个国家都有相应的标准及检测方法[4-6]. 目前，我国对于土霉素和多西环素的测定，常用的方法有高效液相色谱法(HPLC)、紫外分光光度法[7]、电化学分析法[8-10]、荧光法[11-12]和细菌抑制法[13]等.

纳米金比色法灵敏度高，简单、快速，是目前研究比较热门的分析测定方法. 纳米金比色分析的主要优势是通过肉眼即可观察其颜色变化，简单快速，而且省去昂贵复杂的仪器，另外纳米金的消光系数高，灵敏度高，因而比色分析被用于蛋白质，DNA，金属离子和小分子等多种物质的检测，同时被用于蛋白质之间、DNA之间的相互作用研究[14-16]. 目前，纳米金比色法已成功用于三聚氰胺、瘦肉精等物质的检测[17]. 本文采用纳米金比色法测定土霉素和多西环素，测定结果与药典分析结果一致. 此方法简单，测定速度快，而且不需要昂贵的仪器及大量的分析试剂，在食品分析及环境监测方面有很好的应用前景.

1实验部分

1.1仪器与试剂

PHS-3C酸度计(上海仪电科学仪器有限公司)；U-3010紫外-可见分光光度计(日本岛津公司)；F-7000荧光分光光度计(日本日立)； FA1204B电子分析天平(上海佑科仪器有限公司)；CL-2恒温加热磁力搅拌器(郑州长城科工贸有限公司)；Tecnai G2 20s-twin高分辨型透射电子显微镜(日本).

四氯金酸(Sigma-Aldrich 公司)；多西环素，土霉素对照品(中国药品生物制品检定所)；盐酸-乙酸钠缓冲溶液、盐酸-柠檬酸钠缓冲溶液；多西环素片剂(0.1 g，国药准字H13021945)和注射液(0.1 g，国药准字p0060405)为药店随机购买；二次蒸馏水、超纯水由实验室提供，所用试剂均为分析纯.

1.2纳米金的合成[5]

用新配制的王水浸泡所用玻璃器皿24 h，超纯水洗后烘干备用. 将氯金酸配成1%的溶液，精确量取1 mL于100 mL棕色容量瓶中稀释至0.01%. 将0.01%的氯金酸溶液搅拌加热至沸后加入2.75 mL 1%的柠檬酸钠溶液，12 min后颜色由紫红色变为酒红色，冷却至室温，用0.2 μm超滤膜过滤，滤液于棕色试剂瓶中4 ℃保存备用.

1.3测定吸光度

取2.5 mL新制纳米金于5 mL容量瓶中，加入盐酸-柠檬酸钠缓冲溶液，定容. 取2 mL纳米金，依次加入不同体积的多西环素标准溶液(1.50×10-4g·mL-1)/土霉素标准溶液(1.48×10-3g·mL-1)，混合均匀，以水为参比分别测定吸光度.

2结果与讨论

2.1纳米金表征

纳米金呈酒红色，其表观颜色及粒径与文献报道一致. 球形纳米金粒子存在表面等离子吸收的特征峰，以水为空白，绘制纳米金吸收曲线，如图1所示，在518 nm处有最大吸收，据此可计算纳米金的粒径，约为13 nm[18]. 由纳米金的紫外可见吸收光谱图可以看出纳米金颗粒稳定，符合分析要求.

图1　纳米金的紫外-可见吸收光谱Fig.1　Absorption spectra of GNPs

纳米金的透射电镜分析(TEM)如图2所示，制备的纳米金为球形，粒径均匀，分散良好.

图2　纳米金的透射电镜图Fig.2　SEM of GNPs

2.2多西环素/土霉素测定原理

实验利用柠檬酸钠还原氯金酸制备纳米金，纳米金粒子表面包裹大量的柠檬酸根离子，由于静电排斥力纳米金不发生凝聚. 在弱酸溶液中，多西环素/土霉素分子中的氨基官能团(-NH2)可以得到电子(-NH3+)，和纳米金粒子之间通过静电引力相互作用，引发纳米金凝聚. 凝聚后的纳米金透射电镜图如图3所示，纳米金凝聚在一起，证明了纳米金粒子与四环素类抗生素之间的相互作用. 凝聚后纳米金颜色由酒红色变为紫色最终变为蓝色，由于纳米金表面等离子共振，其吸收光谱发生红移和展宽，紫外-可见吸收光谱如图4，纳米金的最大吸收峰由原来的518 nm红移至640 nm. 纳米金的共振散射光谱如图5所示，纳米金凝聚后，共振散射光谱增强. 并且在一定范围内纳米金的聚集与多西环素/土霉素的浓度呈现良好的线性关系，据此可建立简单、快速测定多西环素/土霉素的比色分析.

多西环素0.54 mg·L-1图3　凝聚后的纳米金透射电镜图Fig.3　SEM of GNPs in the presence of doxycycline

(a)不存在多西环素(b)存在0.54 mg·L-1多西环素图4　纳米金的紫外-可见吸收光谱图Fig.4　UV-Vis absorption spectra of GNPs

(a)不存在多西环素(b)存在0.48 mg·L-1多西环素图5　纳米金的共振散射光谱图Fig.5　RRS spectra of GNPs

2.3实验条件优化

将多西环素加入纳米金后，纳米金产生凝聚，其凝聚程度可用Δ(A640/A518)来表示. 在pp.0～7.0范围考查缓冲溶液对测定的影响. 图6显示不同缓冲溶液对测定的影响，结果表明使用盐酸-柠檬酸钠缓冲溶液的测定效果较好. 图7显示缓冲溶液加入量对测定的影响，700 μL pH为2.1的盐酸-柠檬酸钠缓冲溶液引起纳米金凝聚的Δ(A640/A518)值最大. 其原因是pH 过低时，纳米金粒子表面所带负电荷较少, 不利于结合多西环素, 而pH 过高, 多西环素中质子化的氢解离, 使正电荷减少,也不利于结合.

图6　缓冲溶液对Δ(A640/A518)的影响Fig.6　Effect of acidity on determination of doxycycline by using different buffer solutions

图7　盐酸-柠檬酸钠加入量对Δ(A640/A518)的影响Fig.7　Effect of addition of HCl-sodium citrate buffer solution

同时我们也考察了纳米金的用量对体系测定的影响. 改变纳米金的用量从1～3 mL，不同纳米金用量对应的Δ(A640/A518)值如图8所示，纳米金的浓度增大时，其最大吸收峰值降低，当纳米金浓度高时，对仪器的染色比较严重，且对低浓度的多西环素变化不灵敏，当纳米金浓度低时，颜色变化不灵敏，因此实验选择2 mL纳米金.

图9考察了反应时间对测定的影响，连续测定1 h，结果表明:加入多西环素，10 min凝聚程度最大，10 min后基本不再变化，反应时间设为10 min.

图8　不同纳米金用量对应的Δ(A640/A518)Fig.8　Effect of addition of GNPs on Δ(A640/A518)

图9　反应时间对吸收光谱的影响Fig.9　Effect of reaction time on Δ(A640/A518)

2.4多西环素/土霉素的测定

在最优条件下，按照实验方法依次加入多西环素标准溶液并测定其吸收光谱(图10)，由Δ(A640/A518)对多西环素的浓度作图(如图10所示)，线性范围为0.06～0.66 mg·L-1，线性回归方程为Δ(A640/A518)= 0.042+ 1.480 4c(多西环素，mg·L-1),相关系数为0.998，检出限(3σ)为0.008 6 mg·L-1,纳米金比色法测定多西环素具有检出限低，灵敏度高，方法简单等优点，有望应用于食品分析领域.

最优条件下测定土霉素，测定其吸收光谱(图11)，在0.59～8.85 mg·L-1范围内，线性回归方程为Δ(A630/A518) = 0.222 + 0.077c(土霉素，mg·L-1),相关系数0.999，检出限(3σ)0.083 8 mg·L-1.

a→g: 0, 0.06, 0.12, 0.3, 0.42, 0.54, 0.66 mg·L-1.图10　不同浓度多西环素存在下纳米金的紫外-可见吸收光谱图及相应的标准曲线Fig.10　UV-Vis absorption spectra of GNPs in the absence and presence of doxycycline

2.5常见物质的干扰

表1考察了金属离子、氨基酸及结构类似药物的干扰. 结果表明，对于0.54 mg·L-1多西环素，该体系基本不受干扰，有较好选择性.

2.6回收率

取多西环素20片，研细, 精密称取约一片多西环素质量，盐酸溶解后过滤，移至容量瓶，定容. 进行标准加入回收实验，精密量取适量样品溶液，分别加入标准溶液0.06、0.54 mg·L-1，测定吸光度，计算回收率，实验重复3次.

a→h: 0, 0.59, 1.77, 4.13, 6.49, 7.39, 8.26, 8.85 mg·L-1.图11　纳米金与土霉素相互作用的紫外-可见吸收光谱图及相应的标准曲线Fig.11　UV-Vis absorption spectra of GNPs in the absence and presence of oxytetracycline

CoexistingsubstanceMultipleamountadded/(mg·L-1)RelativeDeviation/%CoexistingsubstanceMultipleamountadded/(mg·L-1)RelativeDeviation/%CuSO4MgSO4CaCl2Fe(NO3)3NaClKClNH4ClMnCl2Ba(NO3)2L-leucine6.99127.78257.498.7361.128.047.251.9723.90102.02-0.861.40-2.604.500.814.704.904.18-0.291.10L-valineL-prolineL-threonineL-serineGSHGlucoseVcVb1Vb12193.9381.29143.47504.122.04904.692.66166.932.022.301.903.501.061.431.303.023.704.32

精密量取1 mL多西环素注射液于棕色容量瓶中，进行标准加入回收实验，精密量取适量样品溶液，分别加入标准溶液0.12、0.42 mg·L-1，测定吸光度，计算回收率，结果见表2.

2.7含量测定

精密量取多西环素片剂及注射液样品，按实验方法测定，结果见表3. 测定结果表明所购多西环素片剂及注射液含量在标示范围95.0%～105%内,RSD较小, 符合药品质量管理规定.

表2　多西环素片剂及注射液中多西环素的回收率测定(n=5)

表3　多西环素片剂及注射液中多西环素的测定(n=3)

3结论

采用柠檬酸钠还原氯金酸方法得到纳米金. 在弱酸环境中纳米金可与多西环素、土霉素相互作用，产生凝聚，其吸收光谱发生红移，据此测定多西环素、土霉素. 优化了缓冲溶液、纳米金用量及反应时间等反应条件；在最佳条件下，测定结果令人满意. 同时分析了多西环素片剂及注射液，结果与药典方法结果一致. 该方法简单快速，且不需昂贵仪器及大量分析试剂，在食品及环境分析方面前景广泛.

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[责任编辑：吴文鹏]

Highly sensitive colorimetric detection on doxycycline and oxytetracycline based on gold nanoparticles

QU Li, WEI Yanli, FAN Shumin*

(XinkeCollege,HenanInstituteofScienceandTechnology,Xinxiang453003,Henan,China)

Abstract:The well-dispersed gold nanoparticles (GNPs) were synthesized through sodium citrate reduction method. UV-Vis spectrometer and fluorescence spectrophotometer were used to investigate the mutual effect between GNPs and doxycycline/oxytetracycline. The experimental parameters were optimized with regard to pH, incubation time and concentration of the GNPs. The amino group, which is positively charged in weakly acidic medium (namely, -NH3+), integrates with the negative charge on the surface of gold nanoparticles to form a bigger binding product through electrostatic binding, resulting the aggregation of GNPs with a red-to-purple-to-blue color change. The absorption band of GNPs had a red shift and broadened. Under optimal experimental conditions, the linear ranges of the colorimetric sensor were 0.06-0.66 mg·L(-1) and 0.59-8.85 mg·L(-1) with the corresponding limit of detection (3σ) of 0.008 6 and 0.083 8 mg·L(-1) for doxycycline and oxytetracycline respectively. This method is promising for foods and clinical analysis owing to to its simple, reliable, convenient and low-cost.

Keywords:GNPs; colorimetric method; doxycycline; oxytetracycline

文章编号：1008-1011(2016)02-0189-06

中图分类号：O652.7

文献标志码：A

作者简介：曲黎(1981-)，女，讲师，研究方向分析化学. 通讯联系人，E-mail: fsmhn@aliyun.com.

基金项目：国家自然科学基金(51304064).

收稿日期：2016-01-22.