Notch3在乳腺组织中的表达以及与乳腺癌癌变进展的关系

杜小明　花本林　李玉聪　李怡晓　曹玉文

摘要：目的 检测乳腺组织中Notch3的蛋白表达水平，以及分析其与乳腺癌患者临床病理参数的关系。方法 应用免疫组织化学染色方法检测了Notch3在癌旁正常乳腺组织和乳腺浸润性导管癌中的表达水平，并且运用统计方法进一步分析了Notch3表达水平和乳腺癌患者临床病理参数的关系。结果 Notch3的蛋白水平在乳腺癌组织中显著高于癌旁正常乳腺组织，P=0.000；Notch3的蛋白高表达和乳腺癌患者淋巴结转移呈正相关，P=0.000，在TNM各分期中差异明显，和更高的分期呈正相关，P=0.004；在病理学分级中差异明显，和更高的分级呈正相关，P=0.035。结论 Notch3的高表达可能存进乳腺癌的癌变和进展。

关键词：Notch3；Notch信号通路；乳腺癌

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，也是威胁女性健康的主要原因之一，虽然随着诊断及先进治疗手段的普及，乳腺癌的预后已经较之前有了很大提升，但是乳腺癌整体的防治还亟需继续探寻[1]。而近年来，研究乳腺癌的分子诊断标记物和分子靶向治疗成为一个重点趋势。

Notch3是Notch受体家族中的一员，其位于19q12 染色体上，由 33 个外显子组成，编码1个由2321个氨基酸组成的跨膜蛋白受体，和家族其它成员相似，也是由胞外区、跨膜区和胞内区三部分组成，在和Notch家族配体结合后，激活Notch信号通路，进而发挥调控细胞生长发育、增殖和凋亡以及维持干细胞的作用[2]。进来研究发现包括Notch3在内的Notch信号通路的激活以及其活性分子的活化可以促进肝细胞癌[3]、结肠癌[4]和卵巢癌[5]等肿瘤的发生及进展，特别是Hu C和Chen CF发现在乳腺癌小鼠模型和细胞株中，Notch3的过表达可以促进乳腺癌的发生和进展[6-7]。于是本课题组设想在乳腺癌人组织中验证上述发现。

1资料与方法

1.1一般资料 收集2006年～2014年石河子大学医学院第一附属医院病理科被诊断为乳腺浸润性导管癌（IDC）的石蜡包埋组织标本，共计90例，均为女性，年龄30～72岁，中位年龄55岁，平均年龄50岁，同时收集对照癌旁正常乳腺组织30例。所有样本均由本科室2名高年资病理学医师对HE染色切片进行组织学观察和复查诊断，并进行分型、分级，其中TNM分期，0～Ⅰ期20例，Ⅱ期35例，Ⅲ期35例；病理学分级，高分化（Ⅰ级）乳腺癌13例，中分化（Ⅱ级）乳腺癌50例，低分化（Ⅲ级）乳腺癌27例。

1.2试剂 中性福尔马林固定液、乙醇、二甲苯、枸橼酸盐、Z中性树胶、DAB显色液、H2O2均为国产产品。EnVision试剂盒购自于丹麦Dako公司，Notch3抗体购自abcam公司，克隆号为ab60087，抗体来源兔抗人，稀释浓度为1：200。

1.3免疫组化染色 免疫组化采用Envision法。将烤好的切片依次轻放入二甲苯I、II、III中；然后将脱蜡后的切片按顺序浸入装有梯度乙醇溶液的液缸中；采用微波修复方法，将修复完的切片浸入新配制的3%甲醇双氧水溶液中，室温放置10min，然后用自来水冲洗1～2次；每张切片滴加已稀释至最佳工作浓度的一抗各160μl，放入4℃冰箱过夜，孵育；将过夜后的切片从4℃冰箱取出，室温放置10min；每张切片均滴加二抗各160μl，放入37℃恒温箱，孵育30min；每张切片滴加1～2滴新配制的DAB显色液，显微镜下观察组织显色情况；显色完成后迅速用自来水冲洗，放入苏木素中复染2.5min，盐酸酒精分化4～6s，然后自来水中返蓝3min；切片再次脱水、透明，中性树胶封片。

1.4免疫组化结果评定 Notch3染色后出现细胞浆和/胞膜出现黄色或棕黄色颗粒为阳性细胞，随机选取10个高倍视野（×400），每个高倍视野计数100个细胞，参照许良中[8]等的方法， 再结合本实验室的评定标准，将切片中阳性细胞所占观察细胞数的百分比≤10%计1分，11%～50%计2分，51%～75%计3分，76%～100%计4分；着色强度无着色计0分，淡黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分，由两项积分相加进行评分；0～5分评为阴性表达（-），>6分评为阳性表达（+）。

1.5统计学分析 应用SPSS 17. 0软件进行统计学分析，计数资料采用四格表或列联表χ2检验法，以α=0.05双侧检验为检验显著性水准，P<0.05表示差别有统计学意义。

2 结果

2.1 Notch3蛋白在癌旁正常乳腺和乳腺浸润性导管癌的表达

结果如图1所示，Notch3蛋白表达定位于乳腺癌癌细胞的细胞浆和细胞膜，染色颜色多为棕黄色和棕褐色，阳性细胞所占百分比多为>51%；而在癌旁正常乳腺组织中多无着色或淡黄色，阳性细胞所占百分比多<51%。统计数据结果见表1所示，Notch3蛋白在乳腺浸润性导管癌（IDC）和癌旁正常乳腺组织（ANBT）中阳性表达率分别为52.3%（47/90）和6.7%（2/30），采用χ2 检验比较显示，二者表达差异有统计学意义（P=0.000）。

图 1 Notch3蛋白在乳腺浸润性导管癌（IDC）和癌旁正常乳腺（ANBT）的表达（EnVision×200 1：200）

2.2 Notch3蛋白表达与乳腺癌患者临床病理参数的关系 结果如表2所示，在淋巴结转移阴性（-）和阳性（+）的患者中，Notch3蛋白表达率分别为18%（5/28）和68%（42/62），差异有统计学意义（P=0.000）；在0-I、II和III期的患者中，Notch3蛋白表达率分别为25%（5/28）、49%（17/35）和71%（25/35），差异有统计学意义（P=0.004）；在I、II和III级的患者中，Notch3蛋白表达率分别为23%（3/13）、52%（26/50）和67%（18/27），差异有统计学意义（P=0.035）。

3 讨论

Notch信号通路的激活与乳腺癌的发生发展有着密切的联系，Notch 通路中有5种Notch 配体，包括Jagged1、Jagged2、Delta1、Delta3和Delta4，4种受体，包括Notch1、Notch2、Notch3和Notch4。本实验组前期研究结果表明，Notch信号通路分子中的Notch1蛋白[9]、N1IC蛋白[10]和Snail蛋白[11]高表达分别与乳腺癌变、侵袭转移呈正相关，说明三者可能促进乳腺癌的发生、发展过程。课题组前期也在乳腺组织中检测了Notch1、N1IC及Snail蛋白表达，得出结论与文献结果一致。而除了Notch1，Notch3也被报道其高表达可能导致乳腺癌的发生[6-7]，并且预示着乳腺癌患者有着不佳的预后[12]，而这一些列促乳腺癌癌变的过程可能与Her-2、ER通路有关，抑制 Notch3信号通路可能是靶向治疗乳腺癌的一个新的方向[13]。

本次实验结果表明，Notch3蛋白在乳腺浸润性导管癌组织中明显高于癌旁正常乳腺组织，阐明高Notch3表达可能促进乳腺癌的癌变，这也和前期在小鼠和乳腺癌细胞株中Notch3的研究相符[6-7]，Notch3信号通路的异常参与了乳腺癌的癌变进展。接着我们在分析Notch3表达和乳腺癌患者临床病理特征的关系时发现，Notch3的高表达和乳腺癌患者的淋巴结转移、更高的TNM分期和较差的分化分级呈正相关，提示Notch3的高表达和更差预后及恶性程度更高的乳腺癌联系紧密，而且可能促进了乳腺癌的浸润转移。而且近期有研究揭示，Notch3的高表达和结肠癌的淋巴结转移以及更高的临床分期呈正相关，在低分化卵巢癌、淋巴结转移和血行转移的卵巢癌中Notch3更易发现高表达。这些和我们的发现都进一步提示我们，Notch3可能参与促进乳腺癌的癌变和进展，Notch3表达水平有可能作为预测癌症侵袭转移的重要指标和对预后判断具有一定价值。

当然，本次实验仍存在着种种不足之处。首先，更多的样本量需要被添加在今后的进一步研究中，其次，在乳腺组织中除了检测Notch3蛋白水平外，我们还可以在用RT-PCR方法检测Notch3的mRNA水平，最后，当前估算患者预后较精确的有总生存率和无病生存率，我们可以随访实验纳入的乳腺癌患者的生存资料，进行进一步的生存分析。本次实验结果给予我们后续研究提供了一个基础，也为Notch3可能作为一个潜在的乳腺癌诊断分子标记物和靶向治疗药物提供了初步的实验依据。

参考文献：

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