大鼠脑损伤后EPO及其受体表达与损伤时间的关系

李　伟，齐　麟（铁道警察学院公安技术系，河南郑州450053）



大鼠脑损伤后EPO及其受体表达与损伤时间的关系

李伟，齐麟
（铁道警察学院公安技术系，河南郑州450053）

摘要：目的研究大鼠脑损伤后脑组织中促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）及其受体（erythropoietin receptor，EPOR）的表达与损伤时间的关系。方法72只SD大鼠随机分为对照组（36只）、脑损伤组（36只），在建模后1、2、4、8、12、24h每组各取6只大鼠处死，取挫伤部位脑组织，应用实时荧光定量PCR和Western印迹法检测不同时间点EPO以及EPOR的mRNA表达和蛋白表达情况。结果伤后24h内，EPO及EPOR的表达随损伤时间的增加而呈上升趋势。EPO的mRNA及蛋白表达与损伤时间之间存在相关性，其相关系数分别为0.875、0.911（P<0.05）；EPOR的mRNA及蛋白表达与损伤时间之间存在相关性，其相关系数分别为0.936、0.905（P<0.05）。结论大鼠颅脑损伤早期EPO及EPOR的表达呈逐步上升趋势，与损伤时间具有相关性，可以作为脑损伤时间推断的参考。

关键词：法医病理学；脑损伤；促红细胞生成素；促红细胞生成素受体；损伤时间；大鼠

促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）及其受体（erythropoietin receptor，EPOR）可在中枢神经系统表达，在神经损伤修复中具有重要意义［1］。本研究利用自由落体打击法建立脑损伤模型，检测大鼠脑损伤后EPO及EPOR随损伤时间的变化规律，以探讨颅脑损伤后EPO及EPOR的表达与损伤时间的相关性，为法医学损伤时间的推断提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物及分组

72只雄性SD大鼠（购自郑州大学医学实验动物中心），体质量（250±20）g，随机分为对照组（36只）和脑损伤组（36只）。

1.1.2主要试剂

兔抗大鼠EPO、EPOR及β－actin多克隆抗体（一抗）为美国Santa Cruz公司产品，碱性磷酸酶羊抗兔IgG（二抗）购自美国安玛西亚公司，蛋白Marker购自美国Thermo Fisher公司，NC膜购自美国PALL公司，ECL Western blot显影试剂盒购自美国GE公司，RNA提取试剂盒（Trizol Reagent）购自美国Invitrogen公司，反转录试剂盒（AMV RNA PCR Ver.3.0）购自日本TaKaRa公司，Real－time qPCR Mix购自日本TOYOBO公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3主要仪器

9700型PCR扩增仪、7900HT型荧光定量PCR仪（美国AB公司），DYCZ23A型蛋白垂直电泳槽（北京六一生物科技有限公司），Trans－Blot SD型半干转膜仪（美国伯乐公司），PRISIM 7900HD SDS荧光定量PCR分析软件（美国AB公司），ImageScannerⅢ光密度扫描仪及蛋白分析系统（美国GE公司）。

1.2方法

1.2.1脑损伤模型的建立

脑损伤组均按3mL/kg给予腹腔注射10%水合氯醛，麻醉满意后，矢状切开头皮，显露右顶骨，在矢状缝右侧2mm、人字缝前侧2mm处用骨科空心钻钻孔。下落击杆置于骨窗处，用20 g砝码从40 cm高处自由落体打击下落击杆。术后骨蜡封闭颅骨窗，缝合头皮。

对照组仅麻醉后行开颅骨骨窗操作，但不进行自由落体打击，不进行任何外加干预措施。

1.2.2标本采集

脑损伤模型建立后分别在伤后1、2、4、8、12、24h颈椎脱臼处死对照组和脑损伤组大鼠各6只，取出脑组织，于液氮中保存。

1.2.3实时荧光定量PCR检测

在NCBI基因文库中检测β－actin、EPO及EPOR相应的基因序列，设计并合成引物，详见表1。提取总RNA后合成cDNA，在7900HT型荧光定量PCR仪上运行并重复3次实验后利用PRISIM 7900HD SDS软件进行相对定量数据分析。实验中以β－actin作为内参基因进行实时荧光定量PCR。根据实验测得的EPO、EPOR和β－actin的循环阈值（cycle of threshold，Ct），采用2－ΔΔCt计算目的基因的相对表达量。将对照组中EPO和EPOR的表达量设定为1。

The prevalence of obesity and overweight in outpatients was higher than in inpatients but was not statistically significant.

表1　EPO及EPOR的引物扩增序列

1.2.4Western印迹法蛋白定量

取脑组织进行超声裂解、离心，提取总蛋白，经SDS－PAGE蛋白电泳、转膜后加入一抗，4℃孵育过夜，再加入二抗，按ECL显影试剂盒说明书的操作要求，根据需要选择曝光时间，胶片扫描。应用图像分析软件，以β－actin为内参，以靶蛋白与β－actin灰度的比值作为相对表达丰度，进行蛋白半定量测定。

1.3统计学处理

2　结　果

2.1实时荧光定量PCR检测结果

对照组中，EPO及EPOR在不同时间点的mRNA表达差异无统计学意义（P＞0.05）。在脑损伤组中，EPO及EPOR的mRNA表达在伤后即开始升高，不同时间点与前一时间点之间的表达差异均有统计学意义（P<0.05），与对照组相比，同一时间点的mRNA表达差异具有统计学意义（P<0.05），详见表2～3。

表2　大鼠脑损伤后不同时间点脑组织中EPO mRNA的表达　（n=6，±s）

表2　大鼠脑损伤后不同时间点脑组织中EPO mRNA的表达　（n=6，±s）

注：1）与同一时间点对照组比较，P＜0.05；2）与同组前一时间点比较，P＜0.05

1h　2h　4h　8h　12h　24h对照　2.86±0.31　2.56±0.28　2.72±0.10　2.87±0.29　2.95±0.15　2.94±0.09脑损伤　5.33±0.291）　7.27±0.691）2）　9.87±0.841）2）　11.09±0.731）2）　12.89±1.121）2）　14.53±0.841）2）组别注：1）与同一时间点对照组比较，P＜0.05；2）与同组前一时间点比较，P＜0.05 表3大鼠脑损伤后不同时间点脑组织中EPOR mRNA的表达　　（n=6，±s）1h　2h　4h　8h　12h　24h对照　1.16±0.09　1.13±0.12　1.17±0.07　1.21±0.16　1.26±0.07　1.16±0.17脑损伤　2.92±0.131）　3.16±0.111）2）　3.90±0.091）2）　5.33±0.211）2）　6.89±0.191）2）　7.27±0.081）2）组别

2.2Western印迹法蛋白检测结果

表4　大鼠脑损伤后不同时间点脑组织中EPO蛋白的表达　（n=6，±s）

表4　大鼠脑损伤后不同时间点脑组织中EPO蛋白的表达　（n=6，±s）

注：1）与同一时间点对照组比较，P＜0.05；2）与同组前一时间点比较，P＜0.05

1h　2h　4h　8h　12h　24h对照　0.17±0.02　0.18±0.02　0.17±0.01　0.19±0.01　0.18±0.02　0.17±0.01脑损伤　0.20±0.031）　0.23±0.011）2）　0.30±0.021）2）　0.35±0.011）2）　0.41±0.021）2）　0.48±0.011）2）组别

表5　大鼠脑损伤后不同时间点脑组织中EPOR蛋白的表达　（n=6，±s）

表5　大鼠脑损伤后不同时间点脑组织中EPOR蛋白的表达　（n=6，±s）

注：1）与同一时间点对照组比较，P＜0.05；2）与同组前一时间点比较，P＜0.05

1h　2h　4h　8h　12h　24h对照　0.16±0.01　0.18±0.01　0.21±0.01　0.19±0.02　0.21±0.01　0.19±0.01脑损伤　0.21±0.011）　0.25±0.011）2）　0.31±0.021）2）　0.48±0.011）2）　0.54±0.021）2）　0.61±0.021）2）组别

2.3EPO及EPOR的mRNA及蛋白表达与损伤时间的相关性

经SPSS 16.0软件分析，EPO及EPOR的mRNA及蛋白表达与损伤时间呈正相关，求得损伤时间（y）与脑损伤后EPO的mRNA表达（x1）、蛋白表达（x2）以及EPOR的mRNA表达（x3）、蛋白表达（x4）之间的回归方程如下：y=2.136 x1－13.207（r=0.875）；y=4.161 x2－11.923（r=0.911）；y=74.736 x3－15.893（r=0.936）；y= 46.754 x4－10.163（r=0.905）。

3　讨　论

脑损伤已成为青少年致残和死亡的重要原因之一［2－3］，在暴力性案件中，颅脑损伤所占的比例较大，准确推断脑损伤后的损伤时间能够缩小侦查范围，为侦查提供线索，对于刑事侦查工作具有重要的意义。因此，颅脑损伤形成时间的推断已成为法医学研究的重点和难点问题。传统的损伤时间推断方法以损伤后常规病理形态学改变为依据，但常规形态学的改变往往出现较晚，而且又缺乏明确的时间界限，难以量化，由此推断的早期损伤时间往往精确度较差。由于颅脑损伤不仅表现为脑组织受各种因素作用所产生的形态学改变，同时继发出现的病理生理学变化对脑损伤的研究具有更加重要的意义，在法医病理学领域，对颅脑损伤时间推断的研究已经从大体形态学水平发展到分子水平和基因水平。大量研究［4－5］证实，脑损伤后不同时间点脑组织中神经递质的浓度、细胞因子的含量、部分生物酶的活性及相关基因和蛋白的表达呈现一定的时序性变化，这些规律为颅脑损伤时间推断的研究提供了理论依据。

EPO是调节红细胞生成的糖蛋白激素，起初多认为EPO是一种造血因子，其主要功能是作用于骨髓造血干细胞，促进造血祖细胞的增殖和分化，随着研究的不断深入，大量动物实验和临床试验表明，EPO及EPOR在中枢神经系统也有表达，主要位于神经元、小胶质细胞以及脑血管内皮细胞［6］，而且EPO和EPOR在人类胚胎未分化的神经上皮及胎儿脑组织中表达丰富，出生后EPO和EPOR明显降低［7］，正常人体内EPO及EPOR的水平很低。有研究［8］表明，在缺血缺氧的情况下，星形胶质细胞和神经元中EPOR的表达可迅速上调。EPO及EPOR在神经系统发育过程中呈高表达、出生后表达下降、神经细胞损伤后再次表达上调的特征可能是由于内源性神经保护作用。因此，临床工作者利用EPO及EPOR的这种生物学特性，开展利用外源性EPO治疗脑外伤的理论研究。目前研究多集中于探讨EPO在脑损伤后的生物学效应，为EPO在颅脑损伤的临床治疗提供理论支持［9－10］。

本实验经实时荧光定量PCR及Western印迹法蛋白检测表明，EPO及EPOR在大鼠急性颅脑损伤后的基因和蛋白表达水平均呈升高的趋势，脑损伤后24 h内EPO及EPOR表达量与损伤时间呈较强正相关，这有助于我们探索EPO及EPOR在脑损伤后的生物学效应，可以考虑作为早期损伤时间推断的标记物，为寻找法医学颅脑损伤时间推断方法提供理论依据。

本研究表明，在颅脑损伤早期，脑内EPOR蛋白表达与损伤时间的相关性较EPO蛋白强，用于损伤时间推断时更有意义。有研究［11］认为，脑损伤早期的内源性EPO分泌不足，而EPOR的表达量却明显升高，导致缺乏充足的EPO与EPOR相结合，因而无法启动一系列的神经保护信号传导途径，可能是造成早期的神经细胞损伤的原因之一。因此，本研究从另一角度证实了在脑损伤早期应用EPO治疗的理论基础。

机体损伤后调节EPOR表达的机制尚未完全明确，有研究［12－13］认为，EPOR的表达可能与缺氧诱导因子（hypoxia inducible factor，HIF）、白细胞介素－1β （interleukin－1β，IL－1β）、肿瘤坏死因子－α（tumor necrosis factor－α，TNF－α）等炎症因子以及NO等因素相关。本研究通过自由落体造成大鼠颅脑损伤，可通过生化传导路径激活炎症反应，氧化应激引起血管通透性和细胞兴奋性毒性升高，导致脑细胞损伤［14］，组织的低氧状态可刺激EPOR的表达上调。

本次实验表明，颅脑损伤早期，EPO及EPOR的表达上调具有一定的规律性，与损伤时间呈正相关，并建立了相应的回归方程，为脑损伤时间的推断提供了理论依据。

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（本文编辑：刘宁国）

Relationship between Injury Time and Expressions of EPO and Its Receptors in Rats Brain after Cerebral Injury

LIWei，QI Lin
（Department of Public Security Technology，Railway Police College，Zhengzhou 450053，China）

Abstract：Objective To explore the relationship between injury age and expressions of erythropoietin （EPO）and its receptor EPOR in the brain tissue of rats after cerebral injury.M ethods Seventy－two rats were random ly divided into control group（36 rats）and cerebral injury group（36 rats）.The rats were sacrificed at 1，2，4，8，12，24h after cerebral injury（6 rats at each time point）and the brain tissues were extracted.The expressions of mRNA and protein of EPO and EPOR at different time points were detected by real－time fluorescent quantitative PCR and Western bloting.Results The expressions of EPO and EPOR increased w ithin 24h after injury.The expressions of mRNA and protein of EPO were related to the injury age，and the correlations were 0.875，0.911，respectively（P<0.05）.The expressions of mRNA and protein of EPOR were related to the injury age，and the correlation coefficients were 0.936，0.905，respectively（P<0.05）.Conclusion The expressions of EPO and EPOR increase gradually in the early stage of the rat's cerebral injury，which are associated w ith the injury age and could be a useful value for estimating injury age.

Key words：forensic pathology；cerebral injury；erythropoietin；erythropoietin receptors；injury time；rats

收稿日期：（2015－01－16）

通信作者：齐麟，男，博士，副教授，主要从事脑损伤法医病理学研究；E－mail：qilin＠rpc.edu.cn

作者简介：李伟（1973—），男，副主任法医师，副教授，主要从事法医学教学、科研及检案工作；E－mail：leewei22868＠163.com

基金项目：公安部科技应用创新项目（2012YYCXTDGZ138）

文章编号：1004－5619（2016）02－0090－04

中图分类号：DF795.1

文献标志码：A

doi：10.3969/j.issn.1004－5619.2016.02.003