PTEN在冠心病心肌组织中的表达

李雪榕，何　勇，雷雨佳，覃西河，韦庆涛，潘新民，李立娟，张　林（.四川大学华西基础医学与法医学院，四川成都6004；.河南科技大学法医学院，河南洛阳47003）



PTEN在冠心病心肌组织中的表达

李雪榕1，何勇1，雷雨佳1，覃西河1，韦庆涛1，潘新民2，李立娟1，张林1
（1.四川大学华西基础医学与法医学院，四川成都610041；2.河南科技大学法医学院，河南洛阳471003）

摘要：目的观察冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）患者心肌组织中人第10号染色体缺失的磷酸酶与张力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN）的表达，探讨PTEN的表达与冠心病发生发展的相关性。方法选取经病理学确诊为冠心病死亡案例16例作为冠心病组，非心肌病变死亡案例19例作为对照组，采用免疫组织化学以及实时荧光定量PCR法检测心肌组织中PTEN蛋白及其mRNA的表达。结果冠心病组PTEN蛋白的表达量低于对照组（P<0.05）；与对照组相比，冠心病组PTEN mRNA表达的差异无统计学意义（P>0.05）。结论PTEN可能与冠心病的发生发展有关。

关键词：法医病理学；冠状动脉硬化；心肌；人第10号染色体缺失的磷酸酶与张力蛋白同源基因

冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）指因为冠状动脉狭窄造成心肌供血供氧不足而导致的机能障碍和（或）器质性病变，是当今严重威胁人类健康重要的心血管疾病之一。冠心病常起病隐匿，表现为心绞痛或非典型症状，且易导致猝死。在法医学实践中，因冠心病猝死的案例占心源性猝死案例的50%以上［1］。尽管目前关于冠心病的研究是一个热点，然而关于冠心病发生发展的确切机制至今尚未完全明了。

人第10号染色体缺失的磷酸酶与张力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN）是迄今为止发现的唯一同时具有蛋白质磷酸酶和脂质磷酸酶活性的抑癌基因［2］，位于第10号染色体的10q23上，包括8个内含子和9个外显子，总长200 kb，mRNA长5 500 bp，与细胞的生长、分化、凋亡调控有关［3］，是近年来的研究热点。近几年关于PTEN的研究，逐渐由癌症抑制领域转向缺血预适应、心肌肥大、心肌肥厚等非肿瘤领域。本研究采用免疫组织化学和实时荧光定量PCR法观察冠心病心肌组织中PTEN蛋白及其mRNA的表达情况，以探讨PTEN和（或）其转录产物在冠心病发生发展中的作用，为冠心病猝死诊断提供新的靶点。

1　材料与方法

1.1材料

选取2010—2012年在某法医学鉴定中心经尸体解剖确诊为冠心病死亡的案例16例作为冠心病组，取左心室壁组织；非心肌病变死亡案例19例作为对照组，取左心室壁相同位置心肌组织。心肌组织均制作组织切片，备用。

冠心病组男性13例，女性3例，年龄最小34岁，最大75岁，平均年龄54岁；对照组均为男性，年龄最小11岁，最大58岁，平均年龄37岁。

1.2方法

1.2.1主要试剂与仪器

PTEN多克隆抗体（美国Abcam公司），图像采集使用Olympus BX51显微图像采集系统（英国Olympus Optical公司），图像分析使用Image ProPlus 6.0软件（美国Media Cybernetics公司），实时荧光定量PCR仪（美国Eppendorf公司），High Pure FFPET试剂盒（瑞士Roche公司），DU730紫外分光光度计（美国BECKMAN COULTER公司）。

1.2.2免疫组织化学方法

将心肌组织切片脱蜡至水，3%过氧化氢封闭，95℃高压蒸汽修复抗原，消除内源性过氧化物酶的活性，滴加一抗（PTEN多克隆抗体）、生物素标记的二抗，DAB显色，苏木素复染，最后中性树胶封固。PTEN蛋白呈现棕黄色为阳性。每一张切片在显微镜放大400倍下，随机选取5个不同视野，用Image Pro Plus 6.0软件测定光密度，计算平均光密度值进行半定量分析。

1.2.3RNA提取与逆转录

样品总RNA的提取采用High Pure FFPET试剂盒，具体操作按照试剂盒说明书进行。采用紫外分光光度计，检测波长260 nm、280 nm的光密度（D），取D260/D280测定RNA浓度和纯度。逆转录成cDNA，样品分装保存于－80℃。

1.2.4实时荧光定量PCR法

采用实时荧光定量PCR法测定心肌组织PTEN和内参18S mRNA的表达。根据NCBI数据库中PTEN 和18S的基因序列，采用Primer 3设计引物。PTEN 的F：5′－ACCGCCAAATTTAATTGCAG－3′，R：5′－TAG GGCCTCTTGTGCCTTTA－3′；18S的F：5′－GCAATTAT TCCCCATGAACG－3′，R：5′－GGCCTCACTAAACCATC CAA－3′。引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。

实时荧光定量PCR反应采用SYBR Green法，反应体系为10μL，含mix 5μL、上下游引物各1μL、cDNA 1μL和去RNA酶水2μL。实验采用双标准曲线法，PTEN和内参18S基因标准品10倍等比稀释后实时荧光定量PCR扩增，以标准品拷贝数的对数为x，相应的Ct值为y，得到标准曲线，具体步骤按照试剂盒说明书进行。反应条件：95℃5min；95℃10 s，60℃30s，循环60次；95℃15s，60℃1min，95℃15s， 60℃15s；收集荧光信号进行溶解曲线分析。以PTEN 与18S的比值作为每个样本PTEN的相对表达量。

1.3统计学处理

2　结　果

2.1心肌组织中PTEN蛋白的表达

与对照组相比，冠心病组心肌细胞胞质呈深浅不一的棕黄色（图1A），而对照组多数细胞胞质内PTEN表达阳性，且少数细胞表达强阳性（图1B）。对PTEN阳性细胞进行光密度值测定，结果见表1～2。对照组PTEN蛋白平均光密度值为0.103±0.055，冠心病组为0.039±0.026，两组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。

图1　冠心病组和对照组心肌PTEN蛋白表达情况对比SP×400

表1　冠心病组PTEN阳性细胞平均光密度值结果（n=5）

2.2心肌组织中PTEN mRNA的表达

从标准曲线（yPTEN=－3.422 x+1.24，y18S=－3.191 x+ 1.06）看，PTEN和18S的斜率分别为3.42和3.20，扩增效率均在90%～110%。两条标准曲线的决定系数R2分别为0.99和0.98，说明所得直线拟合优度好。冠心病组PTEN mRNA相对表达量为0.002 5±0.003 2，对照组为0.002 4±0.003 5，两组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。

3　讨　论

在法医学实践中，心源性猝死（sudden cardiac death，SCD）是最常见的猝死。1996年，Kuller报道猝死病因中冠心病占61%［4］。仅在2006年美国SCD案例就达到450000例［5］。SCD的发生具有自发性、突然性和不可预测性［6］。死亡多发生在发病后1～2h内，常规病理学检验多只见心肌肥大、嗜酸性变等改变［4］，缺乏典型的形态学标准，加之死后组织腐败、自溶等的影响，都给冠心病猝死的诊断和鉴定增加了难度［3］，使冠心病猝死的诊断成为法医学研究的热点。目前，关于冠心病猝死的辅助性诊断指标研究主要集中在心肌蛋白，如肌钙蛋白［7］、肌动蛋白［8］、肌红蛋白［9］、纤维粘连蛋白［8，10－11］、内皮素［12］、血管内皮生长因子［13－15］、热休克蛋白70［1］等。

PTEN不仅在胚胎的发育，细胞生长、分化、凋亡和迁移等方面的调控中发挥重要作用［16－17］，而且在心肌细胞MAPK/PKC信号通路、PI3K/AKT去磷酸化、缺血预适应、心肌缺血/再灌注损伤、心肌肥大、心肌肥厚等病理生理过程方面发挥着一定的作用［18－19］。在冠心病的状态下，由于冠状动脉粥样硬化的发生，局部心肌组织发生供血障碍，从而引起心肌细胞对于缺血缺氧这一刺激的反应和适应。PTEN作用于心脏的方式不同于其对癌症细胞的抑制作用，其表达量会发生一定的改变［20］，从而使心脏对所处的这种缺血缺氧状态进行适应性反应。

本研究通过免疫组织化学方法测定PTEN蛋白在冠心病患者心肌组织中的表达情况，并用实时荧光定量PCR法检测冠心病患者心肌组织中PTEN mRNA的表达量，发现PTEN蛋白的表达在正常心肌细胞中较冠心病心肌细胞高，且差异具有统计学意义。说明在冠心病发生时，PTEN的转录量减小，从而使PTEN蛋白的总作用量同比减小，使其作用于心肌细胞所产生的效应亦随之减小。但PTEN mRNA在正常心肌细胞和冠心病心肌细胞中的表达量并未发现明显差异。此研究结果与杨大春等［3］报道的PTEN在心肌重构病理过程中起负性调节的生物学作用的结论相一致。本研究结果表明，PTEN蛋白的表达差异可能不是由于其转录水平的量变，而是由于转录后的修饰作用，提示PTEN可能参与冠心病的发生与发展［21］。

本研究旨在通过检测冠心病心肌组织中PTEN蛋白及mRNA的表达量，分析PTEN与冠心病发生发展的关系，为后续PTEN相关信号通路在冠心病发生和发展中的作用以及冠心病的防治等相关研究提供新的靶点。

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（本文编辑：张建华）

Expression of PTEN in Myocardial Tissue in Coronary Heart Disease

LI Xue－rong1，HE Yong1，LEIYu－jia1，QIN Xi－he1，WEIQing－tao1，PAN Xin－min2，LILi－juan1，ZHANG Lin1
（1.West China School of Preclinical and Forensic Medicine，Sichuan University，Chengdu 610041，China；2.School of Forensic Medicine，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，China）

Abstract：Objective To observe the expression of phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten（PTEN）in myocardial tissue in patients w ith coronary heart disease，and explore the relevance between the expression of PTEN and the occurrence and development of coronary heart disease.M ethods A total of 16 death cases w ith pathological diagnosis of coronary heart disease were collected as experimental group，and 19 cases w ithoutmyocardial lesions were selected as control group.The expression of PTEN protein and its mRNA were detected by immunohistochemistry and real－time fluorescence quantitative PCR respectively.The correlation between the expression of PTEN and the pathogenesis of coronary heart disease was analyzed.Results The expression of PTEN protein in myocardium in cases w ith coronary heart disease was significantly lower compared w ith the control group（P<0.05）.There was no statistical difference of the expression of PTEN mRNA between experimental and control group（P>0.05）. Conclusion PTEN may be involved in the occurrence and development of coronary heart disease.

Key words：forensic pathology；coronary arteriosclerosis；myocardium；phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten

收稿日期：（2014－11－04）

通信作者：张林，男，教授，主要从事法医遗传学研究；E－mail：zhanglin＠scu.edu.cn

作者简介：李雪榕（1991—），女，主要从事法医病理学研究；E－mail：spiderbox＠hotmail.com

文章编号：1004－5619（2016）02－0094－03

中图分类号：DF795.1

文献标志码：A

doi：10.3969/j.issn.1004－5619.2016.02.004