PEG介导的苹果果生刺盘孢Colletotrichumfructicola原生质体转化

韩小路，白静科，张 　玮，张　荣，孙广宇

(西北农林科技大学 植物保护学院,陕西杨凌　712100)



PEG介导的苹果果生刺盘孢Colletotrichumfructicola原生质体转化

韩小路，白静科，张 玮，张荣，孙广宇

(西北农林科技大学 植物保护学院,陕西杨凌712100)

摘要为建立PEG介导的苹果果生刺盘孢Colletotrichum fructicola的遗传转化体系，以果生刺盘孢SQ06-E的幼嫩菌丝为受体，通过PEG介导的原生质体转化法，将含有潮霉素标记的质粒pCB1003转入果生刺盘孢菌丝的原生质体中；对获得的转化子进行遗传稳定性检测、PCR检测和Southern杂交分析。试验获得果生刺盘孢的最优转化体系为：密度为1×106 mL-1分生孢子在M3S培养基中，28 ℃、200 r/min震荡培养8 h；过滤收集菌丝，在质量浓度为0.25 g/mL崩溃酶+0.05 g/mL溶壁酶的10 mL酶解液中加入0.5 g湿菌体酶解3 h；整个试验的渗透压稳定剂为0.8 mol/L KCl。试验共得到76个转化子，转化率为1 μg DNA获得3～4个转化子。对转化子的PCR检测和Southern杂交分析都表明hph基因已整合入果生刺盘孢的基因组中。所有转化子在PDA培养基上继代5次后仍能正常生长，说明外源基因hph能在果生刺盘孢中稳定遗传。

关键词苹果炭疽叶枯病；遗传转化；转化子鉴定

苹果炭疽病是由刺盘孢属(ColletotrichumCda.)的真菌引起的一类重要病害，包含果实上的苦腐病(Bitter rot of apple)和叶片上的叶枯病(Glomerellaleaf spot)[1]。苦腐病主要引起大量落果、果实腐烂、降低果品的产量和质量，并可能危害后期的贮藏和运销。叶枯病是一种流行性很强的病害，一旦发生，造成早期大量落叶，树势变弱，枝条二次开花和发芽，对苹果产业威胁很大[2-3]。随着分子生物学技术在分类学中的应用，特别是“系谱一致性系统发育种识别(Genealogical Concordance Phylogenetic Species Recognition，GCPSR)”理论[4]的提出，使许多复合种得以澄清，刺盘孢属的分类有很大变化，以前被认为是苹果炭疽病病原菌的真菌分类地位有很大变动[5-7]。引起中国苹果炭疽叶枯病的病原被鉴定为果生刺盘孢(C.fructicola)和隐秘刺盘孢(C.aenigma)，其中果生刺盘孢为优势种[8]。

目前，刺盘孢属已有6个种完成基因组测序，故对刺盘孢的研究已经进入后基因组时代[9-12]。因此，建立方便、高效的遗传转化体系对进一步研究刺盘孢的功能基因组学和致病机制有重要意义。PEG介导的原生质体转化方法是使用较早的细胞融合方法，由Kao等[13]建立。PEG介导的原生质体转化在丝状真菌中应用广泛，如在稻瘟菌[14]、禾谷镰刀菌[15-16]等病原真菌中进行信号转导、生长发育、致病等相关基因敲除突变体的研究取得许多重要进展。Rodriguez等[17]首次使用PEG介导的原生质体转化方法将amdS+和hygBR基因成功转入豆刺盘孢(Colletotrichumlindemuthianum)中，开启刺盘孢的转化研究。目前，已报道的利用PEG介导转化的刺盘孢有胶孢刺盘孢(C.gloeosporioides)[18]、瓜类刺盘孢(C.lagenarium)[19-21]和三叶草刺盘孢(C.trifolii)[22-23]等。但是研究[20,23]发现，不同刺盘孢的原生质体制备条件和转化条件都存在差异。

建立方便、稳定、高效的苹果果生刺盘孢遗传转化体系是研究基因功能的前提，而在众多转化方法中，PEG介导的原生质体转化方法在基因定点敲除上有很大优势。在该方法中能否制备大量完整的原生质体是转化成功与否的关键。目前，有关苹果果生刺盘孢原生质体制备及PEG介导的遗传转化研究尚未见报道。因此，本研究建立PEG介导的苹果果生刺盘孢原生质体转化体系，为进一步研究果生刺盘孢功能基因组学和致病机制奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1供试菌株和质粒苹果果生刺盘孢SQ06-E为西北农林科技大学植物保护学院真菌研究室于2012年从河南商丘的苹果叶片上分离纯化得到；携带潮霉素磷酸转移酶基因(hph)的质粒pCB1003由西北农林科技大学许金荣教授惠赠。

1.1.2供试引物、培养基和试剂检测潮霉素抗性基因的引物序列为H852：5′-AACTCACCGCGACGTCTGTC-3′，H850：5′-TTGTCCGTCAGGACATTGTT-3′[24]，由上海生工生物有限公司合成。

CMC培养基：羧甲基纤维素钠15 g，NaNO31 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O0.5 g，酵母膏1 g，加水定容至1 000 mL[25]。

M3S培养基：MgSO4·7H2O 2.5 g，KH2PO42.7 g，蛋白胨1 g，酵母膏1 g，蔗糖10 g，加水定容至1 000 mL[26]。

TB3培养基：酵母膏3 g，酸水解酪蛋白3 g，蔗糖200 g，加水定容至1 000 mL[27]。

Top Ager：酵母膏3 g，酸水解酪蛋白3 g，蔗糖200 g，琼脂15 g，加水定容至1 000 mL[27]。

Bottom Ager：酵母膏3 g，酸水解酪蛋白3 g，蔗糖200 g，琼脂10 g，加水定容至1 000 mL[27]。

STC溶液：蔗糖200 g，0.5 mol/L Tris-HCl 100 mL，KCl 7.351 g，加水定容至1 000 mL[27]。

PTC：40 g PEG 8000 ，用STC定容至100 mL，加热溶解，4 ℃保存[27]。

潮霉素B和DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I购自德国Roche公司。MiraCloth购自美国Calbiochem公司。崩溃酶(Driselase)和溶壁酶(Lysing Enzymes)购自美国Sigma公司。其他常规分子生物学试剂均购自TaKaRa公司。

1.2潮霉素质量浓度与供试苹果炭疽菌的关系

配制潮霉素B质量浓度梯度(0、30、60、90和100 mg/L)的PDA平板，在活化好的果生刺盘孢菌落边缘打取菌饼(d=6 mm)，接种在平板中央，25 ℃培养5 d后观察菌落生长情况。每个处理3个重复。

1.3果生刺盘孢分生孢子诱导及萌发

1.3.1果生刺盘孢分生孢子的诱导将果生刺盘孢SQ06-E接种于PDA平板上活化培养7 d，挑取3块2 cm2的菌饼接种到装有100 mL CMC培养基的250 mL三角瓶中，25 ℃、180 r/min震荡培养72 h，诱导产孢。

1.3.2分生孢子数与分生孢子萌发的关系震荡培养72 h后，用1层MiraCloth过滤，收集液体，3 500 r/min离心10 min，弃上清。用无菌水冲洗孢子2遍，再用无菌水将孢子配成一定密度的悬液，加入到100 mL M3S培养基中，培养基中孢子终密度分别为1×103、1×104、1×105、1×106和1×107mL-1，28 ℃、250 r/min震荡培养8 h后计孢子萌发率并测量菌丝长度。每个密度3个重复。

1.4果生刺盘孢原生质体制备的影响因素

将分生孢子悬液配成最适密度，加入到装有100 mL M3S培养基的250 mL三角瓶中，28 ℃、250 r/min震荡培养8 h，用1层MiraCloth过滤培养基并收集菌丝，再用0.8 mol/L KCl冲洗2次，将菌丝分装于50 mL离心管中，每管0.5 g，加入10 mL酶解液，在摇床上31 ℃、80 r/min振荡酶解3 h。用3层擦镜纸和1层MiraCloth过滤酶解混合物到50 mL离心管中，室温、3 500 r/min离心10 min，收集原生质体，用STC溶液冲洗原生质体后悬浮，血球计数板计数，每次试验设3个重复，每个重复计数3次，计算平均值。

1.4.1菌龄供试菌株分生孢子培养时间分别为8、10、12和14 h，其他操作同“1.4”。

1.4.2酶质量浓度分别用质量浓度为1.5、2.0、2.5和3 g/mL的崩溃酶与0.05 g/mL的溶壁酶配成酶解液处理菌丝，其他操作同“1.4”。

1.4.3酶解时间菌丝于酶解液中的酶解时间分别为2.0、2.5、3.0和3.5 h，其他操作同“1.4”。

1.4.4渗透压稳定剂浓度渗透压稳定剂分别是浓度为0.7、0.8、1、1.2和1.4 mol/L的 KCl溶液，冲洗菌丝和配制酶解液的渗透压稳定剂浓度保持一致，其他操作同“1.4”。

1.5果生刺盘孢原生质体的转化

将制备好的原生质体用STC重新悬浮到2～5×107mL-1。加入10～20 ng的DNA片段到含有200 μL原生质体悬浮液的50 mL离心管中，轻轻混合均匀后室温静置20 min。缓慢加入1 mLw=40%的PTC(用细菌过滤器过滤)到管中轻轻混匀，静置20 min。加入TB3，25 ℃、80 r/min摇床中过夜。3 500 r/min离心10 min，弃上清，余下1 mL残夜将剩余物悬浮。加入10～15 mL Bottom Ager(含抗生素和潮霉素B)，混匀后倒板，室温培养10 h。用10 mL Top Ager覆盖于平板上，25 ℃下培养2～3 d，挑取转化子。

1.6果生刺盘孢转化子的鉴定

1.6.1转化子遗传稳定性检测挑取果生刺盘孢转化子接种于含潮霉素的PDA平板上，继代培养5次，观察转化子对潮霉素抗性的情况。

1.6.2转化子的PCR检测用CTAB法提取果生刺盘孢转化子和野生型菌株SQ06-E的基因组DNA，以潮霉素磷酸转移酶特异性引物H852和H850进行PCR扩增，检测hph基因的插入和整合情况。PCR反应条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性20 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸70 s，循环37次；72 ℃延伸10 min。PCR产物用10 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6.3转化子的Southern blot分析基因组DNA使用BioFlux的真菌基因组提取试剂盒提取，PstⅠ单酶切后进行琼脂糖凝胶电泳分析。以hph的PCR产物为模板，探针标记和检测方法按照试剂盒(DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅠ)说明书进行，检测转化子基因组中hph基因的插入拷贝数。

2结果与分析

2.1潮霉素对供试果生刺盘孢的影响

将果生刺盘孢接种于含有不同质量浓度潮霉素B的PDA平板上，培养5 d后观察果生刺盘孢的生长情况。结果表明，当潮霉素质量浓度为30 mg/L时，SQ06-E菌株就已经停止生长，由于潮霉素有见光分解的特性，考虑培养时间较长，故选择50 mg/L潮霉素B进行阳性转化子的筛选。

2.2分生孢子密度对分生孢子萌发的影响

将分生孢子悬液配成1×103、1×104、1×105、1×106和1×107mL-1的密度，于250 mL三角瓶中振荡培养8 h，孢子萌发率及萌发后菌丝的长度如图1所示。结果表明，当孢子密度为1×103、1×104和1×105mL-1时，孢子萌发率均为100%，而当孢子密度为1×106和1×107mL-1时，孢子萌发率降至60%和11%。同时，当孢子密度为1×103、1×104和1×105mL-1时，孢子萌发长出的菌丝长度约为890 μm，而当孢子密度为1×106和1×107mL-1时，菌丝长度明显变短为380和240 μm(图1)。由此可知，当分生孢子密度过高时，孢子的萌发和菌丝的生长都存在一定地自抑作用，而孢子密度过低又收集不到大量幼嫩菌丝，当分生孢子悬液密度为1×106mL-1时，孢子的萌发率、菌丝量和菌丝长度最适宜。

柱上不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同

Different letters in column indicate significant difference atP<0.05.The same below.

图1孢子密度与孢子萌发率和菌丝长的关系

Fig.1Relationship between spore density and spore

germination rate and hyphae length

2.3原生质体制备条件优化

2.3.1菌 龄当分生孢子震荡培养到8～14 h时，每2 h取样1次，酶解试验所用菌丝菌龄分别为摇培8、10、12和14 h 4个对照。当果生刺盘孢的摇培时间为8 h时，获得的原生质体数量最多，可达3.64×106mL-1(图2)。分生孢子摇培时间过短，菌丝生长较短，收集不到大量的幼嫩菌丝；而摇培时间过长，菌丝的细胞壁生长过厚，不易酶解。故摇培时间过短或过长，原生质体的产量均有所下降。因此，选择分生孢子在25 ℃、200 r/min摇培8 h后酶解，获得的原生质体最多。

2.3.2酶质量浓度分别用质量浓度为1.5 、2、2.5和3 g/mL的崩溃酶与0.05 g/mL的溶壁酶混合配成酶解液处理菌丝。当崩溃酶的质量浓度为2.5 g/mL时，获得的原生质体数量最多，可达3.24×106mL-1(图3)。酶质量浓度过低时，得不到足够量的原生质体。而酶质量浓度过高时，过量的酶会继续降解原生质体，导致原生质体量减少，同时还会影响原生质体的再生。

图2　孢子培养时间与原生质体量的关系

图3　酶质量浓度与原生质体量的关系

2.3.3酶解时间在质量浓度为2.5 g/mL崩溃酶+0.05 g/mL溶壁酶的酶解液中酶解菌丝，菌丝分别酶解2、2.5、3和3.5 h。当菌丝酶解3 h时，获得的原生质体数量最多，达到3.21×106mL-1(图4)。酶解时间过短，菌丝未被酶解完全，得到原生质体数量少；而酶解时间过长，已形成的原生质体会被酶破坏，导致原生质体数量减少；同时，酶解时间过长会导致原生质体再生困难。

2.3.4渗透压稳定剂浓度渗透压稳定剂起保护作用时，需要一定浓度，其浓度过高或过低都会最终影响原生质体的产量和质量。浓度过低时，原生质体释放后体积较大，容易破裂；而浓度较高时，不利于原生质体的释放，且形成的原生质体较小，对再生和转化效率都有影响。试验中，分别使用浓度为0.7 、0.8、1、1.2和1.4 mol/L的KCl溶液作为渗透压稳定剂。结果表明，使用浓度为0.8 mol/L的KCl溶液为渗透压稳定剂时，获得原生质体量最多，达2.8×106mL-1(图5)。

图4　酶解时间与原生质体量的关系

图5　稳渗剂浓度与原生质体量的关系

2.4果生刺盘孢转化子的验证

将所有果生刺盘孢的转化子在含潮霉素B的PDA培养基上连续培养5代后，发现所有转化子仍表现出对潮霉素B的抗性，表明hph基因已经插入基因组中，并随着菌丝的有丝分裂能够稳定遗传。利用潮霉素磷酸转移酶基因的特异性引物H850和H852对上述转化子进行PCR检测，结果显示，所有转化子和质粒对照均能扩增到750 bp大小的特异性条带，而在野生型菌株中未扩增到目标片段，初步证明潮霉素磷酸转移酶基因成功插入并整合到果生刺盘孢基因组中，并且具有遗传稳定性(图6)。

以潮霉素磷酸转移酶基因片段(750 bp)为探针，对果生刺盘孢的转化子进行Southern blot杂交分析，由图7可知，野生型菌株SQ06-E未能杂交到任何条带，但质粒对照和7个转化子均可杂交到特异性条带，由此证明hph基因已整合到果生刺盘孢基因组中，其中转化子SA3、SD12、SB14、SC11、SD9和SD11都有多拷贝插入，只有转化子SA7为双拷贝插入。

M.DL2000 DNA marker;CK.质粒pCB1003Plasmid pCB1003; W.野生型菌株SQ06-EWide-type strain SQ06-E; 1～15.转化子Transformants

图6果生刺盘孢部分转化子的PCR检测结果

Fig.6 PCR detection results of partial transformants

ofColletotrichumfructicolastrain SQ06-E

M.DNA 分子量标准λ-Hind Ⅲλ-Hind Ⅲ digest DNA Marker; CK.质粒pCB1003Plasmid pCB1003; 1～7.转化子SA3、SD12、SB14、SC11、SD11、SD9和SA7Transformants SA3,SD12,SB14,SC11,SD11,SD9 and SA7; 8.野生型菌株SQ06-EWide-type strain SQ06-E

图7 果生刺盘孢部分转化子的Southern blot分析

Fig.7Southern blot analysis of transformants

ofColletotrichumfructicolastrain SQ06-E

3讨 论

1990年刺盘孢属第1次国际研讨会在英国巴斯大学举行，汇集分类学、分子生物学、植物免疫和病理学各领域的专家，这次会议促进分子生物学技术在刺盘孢领域的大规模应用[28]。自此以后，随着多基因分子系统学的发展和应用，刺盘孢属的系统分类发生巨大变化[6-7,29]，作为引起苹果炭疽类病病原菌的刺盘孢也被重新定义，以前被认为是苹果炭疽病病原菌的胶孢刺盘孢实际上为多种刺盘孢的复合群。本试验将其中的果生炭疽菌作为供试菌株，建立苹果果生刺盘孢的遗传转化体系。

农杆菌介导的转化(ATMT)和PEG介导的原生质体转化是常用的真菌转化方法。由于ATMT方法具有转化率高和单拷贝插入等优点，在过去的10 a中，该方法在各种真菌中被广泛应用。但是，作为基因敲除等研究的基础，该方法需要反复构建载体以适应不同的敲除片段，过于繁琐。而PEG介导的原生质体转化是应用较早和较普遍的方法，该方法操作简便，能够有效、准确的敲除目的基因。因此，本研究对PEG介导的苹果果生刺盘孢原生质体转化过程中的条件进行优化，获得1个稳定、高效的转化体系，为后续果生刺盘孢致病基因功能研究奠定基础。

Cappellini等[25]发现在震荡条件下羧甲基纤维素(Carboxymethylcellulose，CMC)能使不产孢的Gibberellazeae产生大孢子，在其他真菌中也发现含有纤维素的物质能够诱导产孢[30]。本试验中，果生刺盘孢SQ06-E在固体培养基上不产孢，故采用CMC培养基诱导产孢，结果发现CMC同样能在震荡条件下诱导果生刺盘孢产生大量分生孢子。由于CMC是天然维生素羧甲基化的产物，难分解，不能为真菌孢子萌发提供碳源，同时它还具有良好的乳状、打散、悬浮和粘连作用，这使得诱导产生的分生孢子在培养基中均匀悬浮且不萌发。因此，使用CMC培养基震荡促进产孢的同时可以抑制分生孢子萌发，这就可以保证萌发的分生孢子处于同一生长发育阶段，适于进一步的原生质体制备。

原生质体的数量和质量直接影响转化效率。在原生质体制备过程中，菌龄和菌量都会影响原生质体的产量。Chen等[23]用YPSS培养基静置培养C.trifolii的分生孢子5～7 d后制备原生质体；Takano等[20]用PSY培养基震荡培养C.lagenarium的分生孢子3 d后制备原生质体；Redman等[26]用M3S培养基震荡培养C.lindemuthianum、C.magna和C.coccodes的分生孢子48 h后制备原生质体。本试验中使用M3S培养分生孢子，孢子培养6 h后，由于孢子萌发的菌丝太短，用MiraCloth无法收集到幼嫩菌丝，而孢子培养8 h后，菌丝长度和收集的菌量都能满足制备原生质体的条件。由此看来，不同种刺盘孢分生孢子的萌发条件和萌发速度都存在较大差异。同时，在液体培养基中，果生刺盘孢分生孢子的产生和萌发都需要震荡来提供氧气。

PEG介导的原生质体转化方法具有随机插入多个拷贝的特点，本试验的Southern blot杂交分析表明，外源基因hph已经成功插入随机选择的7个转化子的基因组中，只有转化子SA7中仅有2个拷贝的插入，而其他6个转化子中都有多于2个拷贝的插入，这与PEG介导的原生质体转化方法的特点完全吻合。在获得突变再生的菌丝后，使用有效的选择标记获得转化子是关键步骤，本试验选择的潮霉素B抗性标记基因hph是目前使用较为广泛的选择标记。对于黄瓜炭疽病菌(C.lagenarium)[21]、鳄梨炭疽病菌(C.gloeosporioides)[31]、有节黧豆炭疽病菌(C.gloeosporioides)[32]、杨树炭疽病菌(C.gloeosporioides)[33]等的生长有良好的抑制效果，抑制质量浓度为50～300 mg/L。本试验中，30 mg/L的潮霉素B即可完全抑制苹果炭疽菌的生长。而王海艳等[34]测得的潮霉素B对苹果炭疽病菌(C.gloeosporioides)生长完全抑制的最低质量浓度为300 mg/L。由此看来，潮霉素B对刺盘孢属不同种的生长抑制存在差异，对同一复合群下不同种的刺盘孢生长抑制也存在差异。这可能与刺盘孢属种间和复合种内的生理特性差异有关。

参考文献Reference：

[1]张 荣,王素芳,崔静秋,等.陕、豫两省苹果炭疽病病原鉴定[J].中国农业科学,2009,42(9): 3224-3229.

ZHANG R,WANG S F,CUI J Q,etal.Identification of pathogens causing apple fruit bitter rot in Shaanxi and He’nan provinces[J].ScientiaAgriculturaSinica,2009,42(9):3224-3229 (in Chinese with English abstract).

[2]宋 清,王素侠,杨春亮,等.苹果炭疽叶枯病的研究初报[J].落叶果树,2012,44(2):29-30.

SONG Q,WANG S X,YANG CH L,etal.Preliminary study on apple anthrax leaf blight[J].DeciduousFruits,2012,44(2):29-30 (in Chinese).

[3]孙共明,刘利民,朱其高,等.苹果新病害-苹果炭疽叶枯病的发生与防控[J].果农之友,2011,12:21.

SUN G M,LIU L M,ZHU Q G,etal.A new apple disease - occurrence and prevention of apple anthrax leaf blight[J].FruitGrowers’Friend,2011,12:21 (in Chinese).

[4]TAYLOR J W,JACOBSON D J,KROKEN S,etal.Phylogenetic species recognition and species concepts in fungi[J].FungalGeneticsandBiology,2000,31(1):21-32.

[5]CANNON P F,DAMM U,JOHNSTON P R,etal.Colletotrichum-current status and future directions[J].StudiesinMycology,2012,73: 181-213.

[6]WEIR B S,JACOBSON P R,DAMM U.TheColletotrichumgloeosporioidesspecies complex[J].StudiesinMycology,2012,73: 115-180.

[7]DAMM U,CANNON P F,WOUDENBERG J H C,etal.TheColletotrichumacutatumspecies complex[J].StudiesinMycology,2012,73: 37-113.

[8]王 薇,符丹丹,张 荣,等.苹果炭疽叶枯病病原学研究[J].菌物学报,2015,34(1): 13-25.

WANG W,FU D D,ZHANG R,etal.Etiology of apple leaf spot caused byColletotrichumspp.[J].Mycosystema,2015,34(1):13-25 (in Chinese with English abstract).

[9]O’CONNELL R J,THON M R,HACQUARD S,etal.Lifestyle transitions in plant pathogenicColletotrichumfungi deciphered by genome and transcriptome analyses[J].Naturegenetics,2012,44(9):1060-1065.

[10]GAN P,IKEDA K,IRIEDA H,etal.Comparative genomic and transcriptomic analyses reveal the hemibiotrophic stage shift ofColletotrichumfungi[J].NewPhytologist,2013,197(4):1236-1249.

[11]BARONCELLI R,SREENIVASAPRASAD S,SUKNO S A,etal.Draft genome sequence ofColletotrichumacutatumSensu Lato(Colletotrichumfioriniae)[J].GenomeAnnouncements,2014,2(2):e00112-14.

[12]BARONCELLI R,SANZ-MARTIN J M,RECH G E,etal.Draft genome sequence ofColletotrichumsublineola,a destructive pathogen of cultivatedSorghum[J].GenomeAnnouncements,2014,2(3): e00540-14.

[13]KAO K N,MICHAYLUK M R.A Method for high-frequency intergeneric fusion of plant protoplasts[J].Planta,1974,115(4):355-367.

[14]LI L,XUE C,BRUNO K,etal.Two PAK kinase genes,CHM1 andMST20,have distinct functions inMagnaporthegrisea[J].MolecularPlant-MicrobeInteractions,2004,17(5):547-556.

[15]DING S,MEHRABI R,KOTEN C,etal.The transducin beta like gene FTL1 is essential for pathogenesis inFusariumgraminearum[J].EukaryoticCell,2009,8(6):867-876.

[16]BLUHM B H,ZHAO X,FLAHERTY J E,etal. RAS2 regulates growth and pathogenesisinFusariumgraminearum[J].MolecularPlant-MicrobeInteractions,2007,20(6):627-636.

[17]RODRIGUEZ R J,YODER O C.Selectable genes for transformation of the fungal plant pathogenGlomerellacingulataf.sp.phaseoli(Colletotrichumlindemuthianum)[J].Gene,1987,54(1):73-81.

[18]POPLAWSKI A M,HE C,IRWIN J A,etal.Transfer of an autonomously replicating vector between vegetatively incompatible biotypes ofColletotrichumgloeosporioides[J].CurrentGenetics,1997,32(1):66-72.

[19]TSUJI G,FUJII S,TSUGE S,etal.TheColletotrichumlagenariumSte12-like gene CST1 is essential for appressorium penetration[J].MolecularPlant-MicrobeInteractions,2003,16(4):315-325.

[20]TAKANO Y,KOMEDA K,KOJIMA K.Proper regulation of cyclic AMP-dependent protein kinase is required forgrowth,conidiation,and appressorium function in the anthracnose fungusColletotrichumlagenarium[J].MolecularPlant-MicrobeInteractions,2001,14(10):1149-1157.

[21] KOJIMA K,KIKUCHI T,TAKANO Y.The mitogen-activated protein kinase gene MAF1 is essential for the early differentiation phase of appressorium formation inColletotrichumlagenarium[J].MolecularPlant-MicrobeInteractions,2002,15(12):1268-1276.

[22]DICKMAN M B.Whole cell transformation of the alfalfa fungal pathogenColletotrichumtrifolii[J].CurrentGenetics,1988,14(3):241-246.

[23]CHEN C,HA Y S,MIN J Y.Cdc42 is required for proper growth and development in the fungal pathogenColletotrichumtrifolii[J].EukaryoticCell,2006,5(1):155-166.

[24]徐齐君,胡小平,陈婷,等.PEG介导的棉花枯萎病菌原生质体转化体系的建立[J].棉花学报,2012,24(3):222-228.

XU Q J,HU X P,CHEN T,etal.Protoplast transformation ofFusariumoxysporumf.sp.vasinfectummediated by polyethylene glycol[J].CottonScience,2012,24(3):222-228 (in Chinese with English abstract).

[25]CAPPELLINI R A,PETERSON J L.Macroconidium formation in submerged cultures by a non-sporulating strain ofGibberellazeae[J].Mycologia,1965,57(6):962-966.

[26]REDMAN R S,RODRIGUEZ R J.Factors affecting the efficient transformation ofColletotrichumspecies[J].ExperimentalMycology,1994,18(3):230-246.

[27]李依民.禾谷镰孢菌组蛋白去乙酰化酶基因(HDACs)功能验证[D].陕西杨凌:西北农林科技大学,2011.

LI Y M.Functional characterization of the genesHDACsinFusaruimgraminearium[D].Yangling Shaanxi:Northwest A&F University,2011 (in Chinese with English abstract).

[28]BAILEY J A,JEGER M J.Colletotrichum:biology,pathology and control.CAB Inthernational[M].Wallingford,UK,1992.

[29]DAMM U,CANNON P F,WOUDENBERG J H C,etal.TheColletotrichumboninensespecies complex[J].StudiesinMycology,2012,73:1-36.

[30]DARBY R T,MANDELS G R.Effects of sporulation medium and age on fungus spore physiology[J].PlantPhysiology,1955,30(4):360-366.

[31]YAKOBY N,ZHOU R,KOBILER I.Development ofColletotrichumgloeosporioidesrestriction enzyme-mediated integration mutants as biocontrol agents against anthracnose disease in Avocado fruits[J].Phytopathology,2001,91(2):143-148.

[32]ROBINSON M,SHARON A.Transformation of the bioherbicideColletotrichumgloeosporioidesf.sp.aeschynomeneby electroporation of germinated conidia[J].CurrentGenetics,1999,36(1-2):98-104.

[33]李思蒙,王永林,黄冬辉,等.杨树炭疽病菌原生质体遗传转化的建立及绿色荧光蛋白的表达[J].林业科学,2013,49(5):121-127.

LI S M,WANG Y L,HUANG D H,etal.Establishment of a PEG-Mediated genetic transformation system and expression of green fluorescence protein inColletotrichumgloeosporioides[J].ScientiaSilvaeSinicae,2013,49(5):121-127(in Chinese with English abstract).

[34]王海艳,李保华,张清明,等.农杆菌介导苹果炭疽病菌的遗传转化及转化子鉴定[J].中国农业科学,2013,46(9):1799-1807.

WANG H Y,LI B H,ZHANG Q M,etal.Transformation ofAgrobacteriumtumefaciens-mediatedColletotrichumgloeosporioidesand identification of transformants[J].ScientiaAgriculturaSinica,2013,46(9):1799-1807 (in Chinese with English abstract).

Received 2015-06-01Returned2015-09-12

Foundation itemThe National Natural Science Foundation of China (No.31171797).

First authorHAN Xiaolu,female,master student.Research area:plant pathology and mycology.E-mail: hanxiaolugood@163.com

SUN Guangyu,male,Ph.D,professor.Research area: plant pathology and mycology.E-mail：sgy@nwsuaf.edu.cn

(责任编辑：顾玉兰Responsible editor:GU Yulan)

>PEG-Mediated Transformation ofColletotrichumfructicola

HAN Xiaolu，BAI Jingke，ZHANG Wei，ZHANG Rong and SUN Guangyu

(State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas,College of Plant Protection,Northwest A&F University,Yangling Shaanxi712100,China)

AbstractTo establish the PEG-mediated transformation technology system of Colletotrichum fructicola,we used the fresh hypha of Colletotrichum fructicola strain SQ06-E as recipient and then transformed a plasmid pCB1003 harboring the hygromycin B phosphotransferase gene (hph) into the protoplast of SQ06-E mediated by PEG (polyethylene glycol).The obtained transformants were screened and identified by hygromycin B resistance,PCR and method of Southern Blot analysis.The optimal transformation conditions were that 1×106 spores per milliliter of Colletotrichum fructicola spore suspension were shocked in M3S medium for 8 h in 200 r/min at 28 ℃; collecting 0.5 g hypha and hydrolyzing them in 10 mL enzyme solution which contained 0.25 g/mL Driselase and 0.05 g/mL Lysing enzyme for 3 h;using 0.8 mol/L KCl as the osmotic pressure stabilizer in all experiments.76 transformants have been get and the efficiency reached to 3-4 transformants per microgramme.DNA.Analysis of the transformants by PCR and Southern Blot showed that the selectable marker gene hph was integrated effectively into the genome of Colletotrichum fructicola.After 5 subculturing on PDA,all transformants could grow.This stability test of transformants suggested that the foreign gene hph was stable in heredity.

Key wordsApple Glomerella leaf spot；Genetic transformation；Transformants identification

Corresponding authorZHANG Rong,female,professor.Research area:plant pathology and comprehensive management of apple disease.E-mail: rongzh@nwsuaf.edu.cn

中图分类号S582.28；S432.1

文献标志码A

文章编号1004-1389(2016)03-0442-08

通信作者：张荣，女，教授，研究方向为植物病理学和苹果病害综合治理。E-mail：rongzh@nwsuaf.edu.cn

基金项目：国家自然科学基金(31171797)。

收稿日期：2015-06-01修回日期：2015-09-12

网络出版日期：2016-03-06

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160306.1611.034.html

第一作者：韩小路，女，硕士研究生，研究方向为植物病理学和真菌学。E-mail：hanxiaolugood@163.com

孙广宇，男，教授，研究方向为植物病理学和真菌学。E-mail：sgy@nwsuaf.edu.cn