双孔钾离子通道TASK-1、TRAAK在弱精子症患者精子中的表达*

范 文方胜英周 慧梅红彬

1. 武汉市优抚医院（武汉 430022）；2. 华中科技大学同济医学院计划生育研究所/生殖医学中心

·论 著·

双孔钾离子通道TASK-1、TRAAK在弱精子症患者精子中的表达*

范 文1方胜英1周 慧2**梅红彬1

1. 武汉市优抚医院（武汉 430022）；2. 华中科技大学同济医学院计划生育研究所/生殖医学中心

目的探讨双孔钾离子通道TASK-1、TRAAK在精子中的表达水平及TASK-1、TRAAK在弱精子症发生机制中的作用。方法采用非连续密度梯度离心分离、纯化正常对照组精液标本20例和弱精子症组精液标本30例，提取精子总RNA后，采用RT- PCR，SYBR Green 实时定量PCR检测精子中TASK-1、TRAAK mRNA的相对表达量。结果TASK-1、TRAAK mRNA在正常对照组和弱精子症组精子中均有表达；其中，TRAAK在弱精子症患者精子中的表达量明显低于其在正常对照组精子中的表达量，下降2.3倍，两组之间有明显的统计学差异（P＜0.05），TASK-1在弱精子症患者精子中的表达量与其在正常对照组精子中的表达量没有明显差异（P＞0.05）。结论TRAAK基因在弱精子症患者精子中的表达下调可能与精子活力下降有关，提示TRAAK可能成为弱精子症发病机制研究的一个分子靶标。

双孔钾离子通道; 弱精子症; 逆转录聚合酶链反应

弱精子症是男性不育的重要原因之一。有报道称[1]，超过80%的男性不育与精子运动障碍有关，其中大约20%与精子活动力低下有着直接关系。随着基因敲除技术的发展，目前已有多种动物模型证实近300个基因与男性不育有关，其中包括一些精子动力相关基因如Tektin4 基因[2]、CATSPER1基因[3]、TCTE3基因[4]等。双孔钾离子通道（Two-pore domain potassium channels, K2P）是上世纪90年代发现并克隆一种含4个跨膜片段和2个孔道结构域的钾离子通道亚型，由于K2P通道可以在静息电位处开放，因而也被称为背景钾通道或 漏流钾通道。K2P通道依据结构和功能的性质可被划分为6个亚类：（1）TWIK-1、TWIK-2和KC-NK7；（2）TASK-1、TASK-3和TASK-5；（3）TREK-1、TREK-2 和TRAAK；（4）TASK-2、TALK-1和TALK-2；（5）THIK-1和THIK-2；（6）TRESK。其基因则以KCNK来命名。K2P通道表达分布非常广泛，几乎在各种组织细胞都能发现它们的存在，在不同的组织，K2P通道具有不同的功能。其中，TASK-1[5]广泛表达于中枢神经系统和外周组织，参与维持细胞膜的静息电位和调节细胞的兴奋性，具体在不同的组织细胞中它有着不同的生理功能；TRAAK[6]在小脑中有相对特异和高水平的表达，提示它的活性与神经系统的病理生理过程密切相关。然而，目前尚缺少TASK-1、TRAAK在人类生殖细胞的表达及其与弱精子症发生机制相关的研究。本研究采用 RT- PCR检测TASK-1、TRAAK mRNA在正常男性和弱精子症患者精子中表达有无差异，从而为进一步探讨弱精子症的发生机制提供实验基础和理论依据。

资料与方法

一、资料

（一）研究对象

20例正常男性对照组（年龄22~45岁）精液标本来自2015年8~12月健康体检合格供精志愿者，精子浓度≥15×106/mL，精子活力[（a+b）级精子]百分率≥40%；30例弱精子症组患者（年龄21~47岁）精液标本来自华中科技大学同济医学院生殖医学中心，精子浓度≥15×106/mL，精子活力[（a+b）级精子]百分率＜40%，两组间年龄无统计学差异，精液量、pH、液化时间、正常形态精子百分率均正常，所有的样本均排除支原体、衣原体感染，附睾或睾丸炎，系统性疾病病史，且精浆生化、生殖激素、常规体格检查正常。

（二）主要试剂及仪器

Percoll（Pharmacia，美国），RNA提取试剂盒（Qiagen，德国），RT-PCR试剂盒（TOYOBO，日本），实时荧光定量PCR试剂盒（TOYOBO，日本），其余试剂均为分析纯；WLJY-9000伟力彩色精子质量检测仪（中国），LineGene 9620实时荧光定量PCR仪（BIOER，中国）。

二、方法

（一）Percoll法分离精液

液化后的精液样本采用WLJY-9000伟力精子质量分析仪分析，按其活力分为正常组和弱精子症组。入选样本按文献[7]采用Percoll（取80%和40%两个浓度） 纯化精子，收集80%层底部精子，加入5mL体细胞裂解液（0.1%十二烷基硫酸钠，0.5% TritonX-100，用RNase-free水配制，4℃保存，临用前取出冰浴），吹打分散沉淀，置冰浴15 min，间断吹打，用0.01mol/L PBS（pH 7.4）洗涤3次，显微镜下确认无圆形细胞，计数精子密度。

（二）精子总RNA的提取及逆转录

根据精子密度取1×1 07精子悬液，室温12 000×g，离心2 min，弃上清，精子沉淀用RNeasy Mini Kit 提取RNA，按照试剂盒说明进行操作。RNA 提取主要步骤：精子沉淀加入600μL提取缓冲液RLT，用吸管尖头反复吹打30s，反复通过20G一次性注射器针头10次剪切DNA；加入等体积70%乙醇，吹打混匀后移至吸附柱10 000×g，室温离心30 s，弃洗脱液；加700μL漂洗缓冲液RW1至吸附柱，10 000×g，室温离心30 s， 弃洗脱液；加500μL漂洗缓冲液RPE至吸附柱，10 000×g，室温离心30 s，弃洗脱液；加500μL漂洗缓冲液RPE至吸附柱，12 000×g，室温离心2 min，弃洗脱液；加30μL RNase-free水（用前预热至70℃）至吸附柱的膜上，12 000×g，室温离心1 min，收集管中洗脱所得即为细胞总RNA。取5μL RNA，用UA-1800核酸测定仪测定其纯度和含量，剩余RNA参照试剂盒方法马上逆转录，所得cDNA作为模板用于荧光定量扩增。

（三）荧光定量PCR

参照实时荧光定量PCR试剂盒方法及PCR仪使用方法，实时定量 PCR 反应体系为：上、下游引物各1.2μL，SYBR Green Realtime PCR Master Mix 15μL，cDNA 2μL，补RNase- free水至30μL。反应条件为：95℃预变性60s；95℃15s，59℃20s，72℃45s，共45个循环，其中72℃45s阶段采集荧光。内参β-Actin、TASK-1和TRAAK基因引物由北京奥科生物技术有限公司设计并合成，序列见表1。TASK-1、TRAAK mRNA的表达采用△△Ct法进行相对定量分析。△△Ct=（实验组内参基因Ct值﹣对照组内参基因Ct值）﹣（实验组待测基因Ct值﹣对照组待测基因Ct值）。基因的表达差异为：2﹣△△Ct。2﹣△△Ct＞2为表达上调，2﹣△△Ct＜0.5为表达下调，2＞2﹣△△Ct＞0.5为表达无明显变化。

表1 PCR引物序列

三、统计学分析

实验数据应用 SPSS 17.0 软件分析，组间比较采用独立样本t 检验，数据以x±s表示，P＜0.05表明差异具有统计学意义。

结 果

一、TASK-1基因在正常对照组和弱精子症组中的相对表达量

正常对照组样本20例和弱精子症组样本30例，TASK-1 mRNA的表达水平如表2所示。可以看出弱精子症样本TASK-1 mRNA的表达水平较正常对照组无明显变化（P＞0.05）。

二、TRAAK基因在正常对照和弱精子症组中的相对表达量

正常对照组样本20例和弱精子症组样本30例，TRAAK mRNA的表达水平如表3所示。可以看出弱精子症样本TRAAK mRNA的表达水平较正常对照组显著降低（P＜0.05）。

表2 正常对照组和弱精子症组中TASK-1 mRNA的表达量（

表2 正常对照组和弱精子症组中TASK-1 mRNA的表达量（

与正常对照组比较，△P＞0.05，△Ct值=待测基因Ct值﹣内参基因Ct值

组别 n Ct (TASK-1) Ct (β-Actin) △Ct △△Ct 2﹣△△Ct对照组 20 24.35±0.87 20.95±1.02 3.38±0.93 0±0.93 1弱精症组 30 24.75±1.0 21.53±0.91 3.22±0.84△0.16±0.84 0.9

表3 正常对照组和弱精子症组中TRAAK mRNA的表达量

表3 正常对照组和弱精子症组中TRAAK mRNA的表达量

与正常对照组比较，﹡P＜0.05，△Ct值=待测基因Ct值﹣内参基因Ct值

组别 n Ct (TRAAK) Ct (β-Actin) △Ct △△Ct 2﹣△△Ct对照组 20 29.33±2.07 20.95±1.02 8.38±2.24 0±2.24 1弱精症组 30 28.66±1.98 21.53±0.91 7.12±2.04*1.26±2.04 0.42

讨 论

不孕不育的诊断和治疗在临床上已经广泛开展，其中弱精子症是男性不育的主要原因之一，它的病因和病理复杂多样，但其显著特征是精子运动能力下降。对弱精子症的探讨也成为学者近年来研究的重要课题。为了深入了解弱精子症的发病机制，人们从分子水平进行了大量的研究，发现了一些与弱精子症相关的基因和蛋白，如基因tektin-2、DNAI1、DNAH5、DNAH11、AKAP4、SEPT4、Smcp，蛋白ACTB、ANXA5、PRM1、PRM2、SABP等均被证实与弱精子症的发生有关[8]，其中大部分与鞭毛的轴丝、线粒体、外周致密纤维相关，但在很大程度上精子动力缺陷的确切分子机制仍不明朗。离子通道可以使精子适应不断变化的微环境，对精子运动、精子活化、顶体反应及受精过程中的趋卵运动十分重要。作为细胞内重要的第二信使，在精子质膜上，Ca2+信号通过质膜上Ca2+相关通道来调节胞内Ca2+浓度的变化，这些通道均被证实存在于精子尾部鞭毛上，在精子运动调控方面发挥着重要作用[9]。其中CatSper通道在精子运动、精子超活化和受精中的作用已有较好的研究，是目前公认的哺乳动物精子细胞上最重要的Ca2+通道[10]。作为CRISPs家族中激素非依赖性,且唯一特异性表达于睾丸的蛋白，CRISP2定位于精子顶体和尾部的外致密纤维鞘，它通过RyR受体调控Ca2+通道的活性,参与精子鞭毛运动的调节、顶体反应和精卵融合等过程[11]。K+通道在精子获能及顶体反应的诱发中也起着举足轻重的作用。其中Slo3是精子特异性K+通道，是生理条件下在精子中起主要作用的K+通道，人和小鼠的Slo3具有组织特异性，均只在睾丸和精子中表达，它介导成熟精子产生pH依赖性钾电流，调控与细胞膜电位相关的信号过程，从而影响雄性生育[12]。作为K2P家族的成员，TASK-1通道对缺氧和pH值变化敏感，参与了呼吸的化学调控[13]，能够调节肺动脉平滑肌细胞收缩[14]，参与形成心肌动作电位平台期[15]，调节醛固酮分泌[16]，还是许多麻醉剂的靶标[17,18]；TRAAK通道可以被多不饱和脂肪酸、机械张力、细胞内碱性条件所激活[19]，在病理状态下对脑缺血提供一种保护机制[20]。Chow等[21]通过免疫印迹和免疫荧光分析附睾的精子样本，第一次证实K2P通道TASK-2、REK-1和TRAAK在非人类灵长类动物的精子中有表达，并且K2P受体激动剂二十二碳六烯酸使表达增强，拮抗剂钆使表达减弱。Hur等[22]首次证明K2P通道在牛生殖器官和生殖细胞的表达，KCNK3、KCNK9、KCNK2、KCNK10、KCNK4在卵巢中、睾丸、卵母细胞、胚胎和精子中均有表达，其中KCNK10、KCNK4在卵母细胞细上有高表达，KCNK3、KCNK4在精子头部高表达。这些均提示K2P通道可能介导生殖细胞的背景K+电导并调节其各种生理过程，如发生、成熟和受精。然而，目前并没有K2P通道在人精子上表达的报道。为了研究K2P通道是否在精子中表达及弱精子症的发生是否与K2P通道有关，我们选取了K2P通道中的亚类TASK-1、TRAAK作为研究，通过 RT- PCR证实，TASK-1、TRAAK mRNA在成熟精子中均有表达，与正常男性相比，弱精子症患者精子中TRAAK表达明显下降，但TASK-1的表达没有变化。由此可以推断，弱精子症患者精子中TRAAK表达的下降，可能会导致精子活力低下。然而，考虑到TREK-1、TREK-2 和TRAAK结构和功能的相似性，其中一种K2P表达的改变可能导致其他K2P表达的变化，因此同时检测三者在弱精子症患者精子中的表达差异可能优于单个指标。另外，虽然研究结果表明TRAAK mRNA在弱精子症患者较正常人表达下调约2.3倍（P＜0.05） ，但由于生物体内 mRNA的表达与蛋白质表达程度往往是不一致的，而真正生物学功能的执行者是蛋白质，因此后续我们会采用 Western印迹技术在蛋白水平上对TRAAK进行进一步检测。总之，TRAAK在弱精子症患者精子中的表达下降，可能是导致精子活力低下的原因之一，但是还需对TRAAK的表达下调的机制以及K2P之间的相互作用作进一步的深入研究。K2P在男性生殖中可能起着十分重要的作用。TRAAK可能是弱精子症发病机制的一个重要分子靶标，值得进一步深入研究。

1 Curi SM, Ariagno JI, Chenlo PH, et al. Asthenozoospermia: Analysis of a large population. Arch Androl 2003; 49(5): 343- 349

2 Roy A, Lin YN, Agno JE, et al. Absence of tektin 4 causes asthenozoospermia and subfertility in male mice. FASEB J 2007; 21(4): 1013- 1025

3 武文斌, 李玉山, 冯晓霞, 等. CATSPER1蛋白与特发性弱精子症关系的研究. 中华男科学杂志 2011; 17(2): 110-114

4 李玉山, 吉晓菲, 王全先, 等. 特发性弱精子症患者精子中TCTE3的表达. 郑州大学学报·医学版 2014; 49(1): 83-85

5 Toyoda H. Involvement of leak K+channels in neurological disorders. World J Neurol 2015; 5(1): 52-56

6 Brohawn SG, Su Z, MacKinnon R. Mechanosensitivity is mediated directly by the lipid membrane in TRAAK and TREK1 K+ channels. Proc Natl Acad Sci USA 2014; 111(9): 3614-9

7 李红钢, 周慧, 官黄涛, 等. 人精子RNA的提取及含量分析. 生殖医学杂志 2008; 17(2): 104-108

8 周其赵, 冯春琼, 毛向明. 弱精子症相关基因与蛋白研究进展. 中华男科学杂志 2009; 15(9): 836- 839

9 Correia J, Michelangeli F, Publicover S. Regulation and roles of Ca2+stores in human sperm. Reproduction 2015; 150(2): R65-R76

10 10. Singh AP, Rajender S. CatSper channel, sperm function and male fertility. Reprod Biomed Online 2015; 30(1): 28-38

11 Da Ros VG, Muñoz MW, Battistone MA. From the epididymis to the egg: participation of CRISP proteins in mammalian fertilization. Asian J Androl 2015; 17(5): 711-715

12 Brenker C, Zhou Y, Müller A, et al. The Ca2+-activated K+current of human sperm is mediated by Slo3. Elife 2014; 3: e01438

13 Trapp S, Aller MI, Wisden W, et al. A role for TASK-1(KCNK3) channels in the chemosensory control of breathing. J Neurosci 2008; 28(1): 8844-8850

14 Olschewski A, Li Y, Tang B, et al. Impact of TASK-1 in human pulmonary artery smooth muscle cells. Circ Res 2006; 98(2): 1072-1080

15 Donner BC, Schullenberg M, Geduldig N, et al.

Functional role of TASK-1 in the heart: studies in TASK-1-deficient mice show prolonged cardiac repolarization and reduced heart rate variability. Basic Res Cardiol 2011; 106(2): 75-87

16 Guagliardo NA, Yao J, Bayliss DA, et al. TASK channels are not required to mount an aldosterone secretory response to metabolic acidosisin mice. Mol Cell Endocrinol 2011; 336(1-2): 47-52

17 Chua MS, Sun H, Cheung ST, et al. Overexpression of NDRG1 is an indicator of poor prognosis in hepatocellular carcinoma. Mod Pathol 2007; 20(1): 76-83

18 Zhang AH, Rao JN, Zou TT. p53-Dependent NDRG1 expression induces inhibition of intestinal epithelial cell proliferation but notapoptosis after polyamine depletion. Am J Physiol Cell Physiol 2007; 293(1): C379-C389

19 李正斌, 王晓良. 花生四烯酸敏感和机械牵张门控的双孔钾离子通道TREK的研究进展. 药学学报 2006; 41(3): 193- 196

20 Laigle C, Confort-Gouny S, Le Fur Y, et al. Deletion of TRAAK Potassium Channel Affects Brain Metabolism and Protects against Ischemia. PLoS One 2012; 7(12): e53266

21 Chow GE, Muller CH, Curnow EC, et al. Expression of two-pore domain potassium channels in nonhuman primate sperm. Fertil Steril 2007; 87(2): 397-404

22 Hur CG, Choe C, Kim GT, et al. Expression and localization of two-pore domain K(+) channels in bovine germ cells. Reproduction 2009; 137(2): 237-44

（2016-07-08收稿）

Expression of K2P channel TASK-1, TRAAK in the ejaculated sperm of asthenozoospermic men*

Fan Wen1, Fang Shengying1, Zhou Hui2**, Mei Hongbin11. YouFu Hospital of Wuhan City, Wuhan 430022, China; 2 Centre of Reproductive Medicine and Family Planning Research
Institute, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology

Zhou Hui, E-mail: zhouhui10191@sina.com

ObjectiveTo investigate the expression level of K2P channel TASK-1, TRAAK in the sperm cells and the role of TASK-1, TRAAK in the pathogenesis of asthenozoospermia.MethodsSemen samples were collected from 20 normal controls and 30 asthenozoospermia patients and purified using Percoll discontinuous density gradients; after extracted the total RNA, the relative expressions of TASK-1, TRAAK mRNA were detected in the two groups by RT- PCR, SYBR Green real- time PCR.ResultsTASK-1, TRAAK mRNA were expressed in the sperm cells both in the normal control group and the asthenozoospermia patient group; the expression of TRAAK mRNA was down- regulated by 2.3 times in the asthenospermia patients, signifcantly lower than in the normal control group (P<0.05), while, there was no signifcant difference of TASK-1 mRNA in the two groups (P>0.05).ConclusionThe down- regulation of TRAAK mRNA in the sperm of asthenospermia patients may be related with decreased sperm motility, which suggests that TRAAK may serve as a potential molecular target for the research of asthenospermia．

K2P channel; asthenozoospermia; reverse transcriptase polymerase chain reaction

10.3969/j.issn.1008-0848.2016.10.002

R 698.2

资助：本课题受湖北省卫生计生科研项目基金资助（WJ2015MB254）

**通讯作者，E-mail: zhouhui10191@sina.com