一株降解淀粉填充聚乙烯放线菌的筛选以及诱变选育

何红，刘沛，罗贝旭，张尔亮*，陶宗娅，亓守美，竹文坤

一株降解淀粉填充聚乙烯放线菌的筛选以及诱变选育

何红1，刘沛1，罗贝旭1，张尔亮1*，陶宗娅1，亓守美1，竹文坤2

(1.四川师范大学生命科学学院，四川成都610066;2.西南科技大学生命科学学院，四川绵阳621010)

目前对聚乙烯降解菌的研究主要集中在细菌和真菌中，放线菌作为聚乙烯降解菌株还鲜有报道.利用添加改良淀粉聚乙烯粉末为唯一碳源和能源的无碳源培养基，从土壤中分离筛选得到一株可以降解淀粉聚乙烯的降解菌LBX－2，通过形态学观察生理生化反应，结合16SrDNA序列进行分类鉴定，菌株LBX－2与Streptomyces albogriseolus的亲缘关系最近，形态学观察和生理生化指标也与之相符，初步鉴定为白浅灰链霉菌.以筛选得到的降解菌LBX－2作为出发菌株，采用吖啶橙－紫外线复合诱变的方法进行诱变选育，吖啶橙最佳诱变剂量为1×10－2g/mL，紫外线最佳诱变持续时间为50 s，诱变株较之原始菌株降解能力提高了41.80%，是一株具有研究和应用潜力的降解淀粉聚乙烯的菌株.

淀粉聚乙烯;放线菌;降解;复合诱变

聚乙烯是乙烯经聚合而成的热塑性树脂.具有耐低温、耐酸碱、化学性质稳定等优良特点，广泛应用于化工、农田塑料生产当中，是全球用量最大的塑料品种之一［1］，但是聚乙烯塑料由于分子量大、疏水性强、表面能低［2］以及缺乏被微生物酶系统所利用的官能团［3］等原因导致其在自然环境中降解速度非常缓慢，长期大量的积累造成了“白色污染”，严重危害着生态环境的健康发展，因此，塑料废弃物的污染治理问题备受关注.

淀粉聚乙烯是为消除白色污染而最早研制开发的降解塑料制品之一，淀粉价格低廉且易于得到，淀粉通过改性处理后，能与聚乙烯以一定比例混合，改良淀粉降解后不会对环境造成污染，而且添加淀粉对聚乙烯的降解具有较强的促进作用［4］.

目前国内外已报道的聚乙烯降解微生物主要以细菌和真菌为主［1］，放线菌作为聚乙烯降解菌株被分离出来还鲜有文章.在本研究中，一株淀粉聚乙烯粉末降解菌Streptomyces albogriseolus从土壤中分离筛选出，这对于丰富聚乙烯降解菌种资源以及促进土壤微生态系统的物质和能源循环都具有一定的意义，并通过吖啶橙－紫外线复合诱变，以期望筛选到淀粉聚乙烯降解效率更高的突变菌株.

1 材料与方法

1.1淀粉聚乙烯粉末聚乙烯粉末，经实验室鉴定淀粉含量为30%.

1.2培养基培养基A:蛋白胨10 g、石蜡油0.1 mL、K2HPO40.7 g、KH2PO40.7g、MgSO4·7H2O 0.7 g、NH4NO31.0 g、NaCl 0.005 g、FeSO4·7H2O 0.002 g、ZnSO4·7H2O 0.002 g、MnSO4·H2O 0.001 g、蒸馏水1 000 mL、pH 7.2.

基础无碳源琼脂固体培养基［5］:K2HPO40.7 g、KH2PO40.7 g、MgSO4·7H2O 0.7 g、NH4NO31.0 g、NaCl 0.005 g、FeSO4·7H2O 0.002 g、ZnSO4·7H2O 0.002 g、MnSO4·H2O 0.001 g、琼脂粉18 g、蒸馏水1 000 mL.

曲利苯蓝培养基:曲利苯蓝0.075 g、可溶性淀粉10 g、(NH4)2SO42.5 g、蛋白胨5 g、MgSO4· 7H2O 0.2 g、FeSO4·7H2O 0.025 5 g、CaCl20.013 g、琼脂粉20 g、蒸馏水1 000 mL、pH 7.5.

1.3土壤梯度稀释液的制备称取10 g填埋有聚乙烯残膜的土壤制成梯度稀释液［6］，取10－4、10－5和10－63个梯度［7］的稀释液放于4℃下冷藏保存待用.

1.4聚乙烯实验样品的预处理取聚乙烯粉末，放在无菌操作台上紫外灭菌2 h，取灭菌后的聚乙烯接种在高氏Ⅰ号培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、马丁氏培养基上，均无菌落生长，视为灭菌彻底.

1.5聚乙烯粉末降解菌的分离将保存的10－4、10－5、10－63个梯度的土壤稀释液0.1 mL分别加入到100 mL培养基A中进行富集培养，每个梯度3次重复，在37℃、170 r/min条件下振荡培养.培养数天后分别转种于含0.1 g聚乙烯粉末的100 mL基础无碳源液体培养基中，每个梯度做3次重复;在37℃、150 r/min的恒温振荡箱中培养，在培养期间每10 d补充新鲜无菌的培养液.60 d后选出2瓶长势较好的混合液，再分别从中吸取0.1 mL菌液转接到含0.1 g粉末100 mL基础无碳源液体培养基中，于37℃、150 r/min下振荡培养18 d，得到混合液A和混合液B.用接种环分别蘸取混合液A、B中的菌液接种于含有0.12 g聚乙烯粉末的基础无碳源琼脂固体培养基(pH 6.0)上，在28℃下恒温培养，15 d后平板上长出了菌落，将培养基长出的不同菌落在基础无碳源琼脂固体培养基划线分离纯化，直至每个平板上长出单一的优势菌株，选取长势最好的一株菌，命名为LBX－2.

1.6菌株鉴定1)形态学观察:参照文献［8］，观察气生菌丝在不同培养基上的颜色变化情况，以及在普通光学显微镜下的孢子和孢子丝的形态观察.

2)生理生化鉴定:明胶液化实验、牛奶胨化实验、淀粉水解实验、酪氨酸水解实验、不同碳源利用实验［9－10］.

3)16SrDNA的全序列克隆测序:将已纯化的菌株送至生工生物工程(上海)有限公司进行16SrDNA全序列的克隆测序.测序结果放入Genebank中进行BLAST比对，利用MEGA 4.0软件制作系统发育树，找出和菌株LBX－2亲缘关系最近的种.

1.7聚乙烯降解测定方法

1.7.1 淀粉含量的变化参照文献［11］计算淀粉含量的变化.

1.7.2 失重法挑取一环LBX－2菌落于高氏Ⅰ号液体培养基中，于37℃、150 r/min的恒温振荡箱中培养5 d，再以1%的接种量接种到含有0.5 g的100 mL基础无碳源液体培养基中，空白组不接种菌，37℃、150 r/min条件下培养15 d.收集未降解完的聚乙烯粉末，先用超纯水清洗数遍，再用超声波清洗仪进行清洗，后将其置于烘箱中直至恒重，取出称量，利用公式计算其失重率.

1.8吖啶橙－紫外线复合诱变

1.8.1 菌悬液的制备取培养至对数期的LBX－2斜面一支，小心将抱子和菌体刮下，置于装有无菌水的三角瓶中，加入灭菌的玻璃珠20粒，置于200 r/min的恒温振荡培养箱中，振荡6 h，使菌体的分散率达到90%左右，随后用8层无菌纱布对孢子悬液过滤，镜检菌悬液中的菌体数，使孢子浓度保持约为107～108个/mL.

1.8.2 吖啶橙诱变准确称取吖啶橙，以无菌水配制成质量分数为1%的工作溶液，以0.22 μm膜过滤除菌备用.将1%吖啶橙溶液进行稀释，加入到高氏Ⅰ号液体培养基中，稀释最终质量浓度为:1×10－1、1× 10－2、1×10－3、1×10－4、1×10－5g/mL 5种［12］，取菌液3 mL分别加入100 mL吖啶橙－高氏Ⅰ号液体培养基中，每个质量浓度3个平行，置于32℃恒温振荡箱培养.5 d后取上述处理过的菌悬液0.1 mL，稀释到10－4、10－52个稀释梯度涂平板，于32℃中避光培养5 d，计算致死率和正突变率［13］.

1.8.3 紫外线诱变将吖啶橙处理后得到的最优性状突变株制成菌悬液准备诱变，诱变在黑暗中进行，其他操作在红光下进行.在正式诱变前，先将紫外灯开启至254 nm，进行30 min的预热，取3 mL菌液于直径为9 cm的平皿内，照射时间分别为: 10、20、30、40、50、60、70 s(照射距离20 cm)，每照射10 s后将菌液搅匀，照射时间累计.将诱变后的菌悬液避光放置1 h，得到最佳紫外波长下，照射时间不同诱变效果曲线.

1.8.4 筛选将诱变菌株接入曲利苯蓝培养基中进行初筛，在32℃恒温箱中培养，观察透明圈，挑选透明圈大的菌株.将初筛得到的菌株，接入淀粉聚乙烯为唯一碳源的基础无碳源固体培养基中进行复筛，并测定其淀粉水解酶的活性.

1.8.5 致死率以及正突变率的计算按照以下公式计算诱变菌株的致死率以及正突变率

2 结论

2.1菌株的鉴定

2.1.1 菌株的形态学以及生理生化鉴定观察菌株在改良高氏Ⅰ号培养基、查氏培养基、马铃薯块、燕麦粉琼脂培养基上的颜色变化情况如表1所示.

表1 不同培养基中的气丝颜色情况Table 1Colour change of the aerial mycelium in different culture media

在荧光显微镜下观察孢子和孢子丝的形态，观察结果如图1所示，孢子呈现卵圆形，孢子丝呈螺旋形.

2.1.2 菌株的分子学鉴定根据16SrDNA的全序列克隆测序的结果，全序列总长为1 517 bp.菌株LBX－2与Streptomyces albogriseolus的亲缘关系最近;同时形态学的观察和生理生化指标也与之相符，因此菌株LBX－2被鉴定为Streptomyces albogriseolus.

2.2降解特性天然淀粉与聚烯烃的相容性极差，难于加工合成，通过对天然淀粉的改性或者是添加增溶剂，可以提高其与聚乙烯的相容性.淀粉聚乙烯里的淀粉在性质和结构上都与天然的淀粉有一定的区别.根据文献［2］，得到淀粉聚乙烯塑料颗粒中淀粉的变化，降解前淀粉含量为30%，降解15天后淀粉减少了14.77%，占淀粉总含量的49.23%，淀粉聚乙烯失重率达到26.54%，通过计算得出淀粉聚乙烯减少了11.77%，占聚乙烯总量的16.81%.

表2 生理生化指标结果Table 2The characteristics of physiological and biochemical index

2.3复合诱变

2.3.1 吖啶橙诱变筛选突变株吖啶橙的诱变结果如图3所示，当处理浓度为1×10－2g/mL时，致死率达到70.08%，获得最大正向突变率为21.30%，随着处理浓度的增加，致死率增加，当处理浓度达到1 ×10－1g/mL时，致死率几乎达到了100%.以前认为致死率在90%～99.9%效果好.但是目前的报道认为致死率在70%～80%有利于正突变型的产生，且筛选的菌株遗传稳定性好.从致死率70.08%的培养基中共挑出60个单菌落，从中再挑出菌落色泽和粘度有异于原始菌株的菌落20个，编号为H1～H20，用曲利苯蓝培养基透明圈法进行初筛，挑选抑菌圈大和抑菌圈透明的菌株.经此法初筛，共得到10株透明抑菌带大于原始菌株的菌株，挑取此10个菌落，在添加聚乙烯为唯一碳源的基础无碳源培养基上复筛，对其中性能优良的3株进行淀粉酶活力测定，最终得到一株菌H－9，降解淀粉聚乙烯能力相对较强，比原始菌株淀粉酶活力提高，故将H－9作为第二次诱变(UV诱变)的出发菌株.

2.3.2 紫外诱变紫外线对H－9的诱变效应如图4所示.在照射时间为50 s时致死率达到83.43%，获得最大正向突变率为19.79%，随着处理浓度的增加，致死率增加，当处理时间达到70 s时，致死率几乎达到了100%.从照射时间50 s的培养基中共挑出50个单菌落，从中再挑出菌落色泽和粘度有异于原始菌株的菌落17个，编号为HH1～HH17.用曲利苯蓝培养基透明圈法进行初筛，挑选抑菌圈大和抑菌圈透明的菌株.经此法初筛，共得到6株透明抑菌带大于原始菌株的菌株，挑取平板菌落共计4个，在添加聚乙烯为唯一碳源的基础无碳源培养基上复筛，对其中性能优良的2株进行淀粉酶活力测定，最终得到一株菌HH－14，降解淀粉聚乙烯能力相对较强，较原始菌株淀粉酶活力提高.

2.4突变株HH－14与原始菌株LBX－2的降解特性比较原始株LBX－2与突变株LBXH－14，等量接种到含有0.5 g的100 mL基础无碳源液体培养基中，于37℃、150 r/min条件下培养15 d，具体统计数据见表3.

表3 原始菌株与突变菌株降解淀粉聚乙烯效果比较Table 3The different degradation effect of the original strain and the mutant strain

本实验通过从填埋聚乙烯膜的土壤中筛选到一株可以降解聚乙烯粉末的菌株，能在聚乙烯为唯一碳源的基础无碳源培养基上生长，通过16SrDNA同源性比对，鉴定其为放线菌Streptomyces albogriseolus，通过化学诱变与物理诱变相结合的方法对LBX－2进行诱变，最终获得一株高效降解淀粉聚乙烯的突变株HH－14，较之原始菌株，降解效果提高了41.8%，这株高效降解菌为今后生物降解聚乙烯提供了良好的研究基础.

3 讨论

在可生物降解塑料领域中，淀粉聚乙烯的应用越来越广泛，淀粉聚乙烯被视为是减轻或消除塑料制品对环境危害的重要手段之一，但是目前对聚乙烯降解菌的研究主要集中在真菌和细菌当中，郑连爽等［14］研究黑曲霉、绳状青霉在受控条件下，对聚乙烯膜的降解量与添加的淀粉呈正相关.还有真菌中的Aspergillus flavus［15］、Penicillium simplicissimum YK［16］都被证明能够降解淀粉聚乙烯.S.Bonhomme等［17］研究细菌中的Rhodococcus rhodochrou，K.Yamada－Onodera等［16］研究细菌中的Brevibacillus borstelensis，都被证明能分解并利用聚乙烯供菌体自身生长［18］，而对放线菌降解淀粉聚乙烯的报道却很少有，本研究筛选出来的放线菌，能在一定程度上丰富聚乙烯降解菌种资源，对探究聚乙烯降解机理起到很好的辅助作用.

一般认为，复合诱变具有协同效应，以多种诱变方法进行复合诱变，可以加大诱变范畴［19］.本实验通过吖啶橙－紫外线复合诱变的方法，选育出一株高效降解淀粉聚乙烯的菌株，较之出发菌株，聚乙烯的降解能力提高了41.8%，郑连爽等［14］利用5株混合真菌在受控试验条件下，对淀粉含量6%～18%的聚乙烯进行降解研究，28 d其降解质量变化率不超过3.2%，低于本研究Streptomyces albogriseolus对淀粉的降解效果，说明该菌株对淀粉聚乙烯中的改良淀粉具有良好的降解能力.与陆辰霞等［20］筛选出一株解淀粉芽孢杆菌，2周降解9.4%聚乙烯的降解量相比，平均降解速率低于本研究菌株的降解速率，说明本菌株具有良好的降解淀粉聚乙烯的能力，并对淀粉聚乙烯中的聚乙烯具有一定的降解潜力.

在纯聚乙烯中添加淀粉，能获得可生物降解塑料，淀粉的加入加快了聚乙烯的降解速率，而导致聚乙烯降解的原因很可能是淀粉对聚乙烯生物降解起到了促进作用，而不是淀粉本身被生物降解利用［4，21］，目前降解机理尚不明了，探索工作正在进行中.

致谢西南科技大学生物质材料教育部工程研究中心(11zxbk03)对本文给予了资助，谨致谢意.

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Isolation and Complex Mutagenesis of an Actinomycetes with Degraded Starch/Polyethylene Powder

HE Hong1，LIU Pei1，LUO Beixu1，ZHANG Erliang1，TAO Zongya1，QI Shoumei1，ZHU Wenkun2
(1.College of Life Science，Sichuan Normal University，Chengdu 610101，Sichuan; 2.College of Life Science，Southwest University of Science and Technology，Mianyang 621010，Sichuan)

At present，the research of polyethylene degradation bacteria mainly focused on the bacteria and fungi，while actinomycetes as degradation strains are rarely reported.In this article，modified Starch/polyethylene powder as sole carbon and energy source were employed.A strain LBX-2 which can degrade starch/polyethylene was isolated from soil and identified by the phenotypic to abtain，physiological and biochemical characteristics.With 16SrDNA gene cloned sequence，the isolated strain LBX-2 was identified to be closely related to Streptomyces albogriseolus.Phenotypic，physiological and biochemical characteristics are the same with Streptomyces albogriseolus.With LBX-2 as the starting stain by using acridine orange and UV irradiation treatment，the best mutagenic effect was proved through experiment 1×10－2g/mL after mutated with acridine orange and 50 s ultraviolet radiation.The isolated strains named Streptomyces albogriseolus can degrade starch/polyethylene powder after complex mutation with acridine orange and ultraviolet radiation，and the degradation capacity can be improved 41.80%higher than that of the original strain.Thus，it is a valuable and potential strain in the research of degradation of Starch/polyethylene powder.

starch/polyethylene;actinomycetes;degradtion;complex mutation

R379.1Q939.96

A

1001－8395(2016)03－0408－06

10.3969/j.issn.1001－8395.2016.03.019

(编辑郑月蓉)

2015－01－31

国家“十一五”科技支撑计划项目子课题(2007BAE42B04－01)和四川省教育厅重点课题(11ZA096)

*通信作者简介:张尔亮(1959—)，男，教授，主要从事微生物学与生物化学的研究，E－mail:1074356205@qq.com