玉米转录因子基因ZmASR1的克隆及植物表达载体构建

张丽丽+李博+谭燕华+曹扬+易小平

摘要：为深入研究玉米转录因子基因ZmASR1的功能，提高玉米株系的产量和抗逆性，根据http：//www.maizegdb.org/ 网站上公布的玉米自交系B73的ZmASR1序列和Cornejo发表的Ubiquitin启动子的序列，设计引物从玉米自交系B73的DNA序列中克隆了ZmASR1基因和Ubiquitin启动子，并对ZmASR1基因进行了生物信息学分析。序列分析结果表明，ZmASR1基因DNA全长为1 381 bp，包含1个长度为131 bp的内含子序列，存在1个完整的开放阅读框417 bp，编码138个氨基酸。氨基酸序列分析表明其具有ASR家族典型的保守结构域ABA_WDS（abscisic acid/water deficit stress），氨基酸序列的N端有该家族成员所特有的依赖于Zn2+的DNA结合位点，而C端则有1个核定位信号，玉米的ZmASR1与单子叶植物的ZmASR1亲缘关系较近，而与双子叶植物的ZmASR1亲缘关系较远。并构建了同时带有该启动子和ZmASR1基因的植物表达载体。

关键词：玉米；Ubiquitin启动子；ZmASR1基因；生物信息学；植物表达载体

中图分类号： Q785

文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）04-0016-06

玉米生产在保障我国粮食安全中具有十分重要的战略地位，玉米在世界范围内广泛种植，是我国播种面积最大的农作物，同时也是我国产量第一大粮食作物，是主要的粮食饲料兼用作物，以产量高、营养丰富且用途广泛而被誉为三冠王——高产之王、饲料之王、加工原料之王。玉米的重要性为玉米的发展提供了难得的机遇，但同时我们也必须清醒地认识到玉米生产中遇到的现实困难。粮食产量下降是由各种生物和非生物胁迫的影响造成的，干旱是最重要的环境胁迫，超过任何其他环境因素，严重损害植物的生长和发育，限制植物生产和作物的性能[1]。玉米是对水分反应敏感的旱地作物，玉米在整个生长发育过程中需水量较大，但其自身的耐旱性较差。我国每年受旱面积大约为种植面积的40%，干旱一般可使玉米减产20%～30%，因此，干旱成为制约我国玉米发展的首要不利因素。随着全球气候变暖、水资源的日益匮乏和干旱的日益加剧，耐旱玉米品种在农业生产中的地位显得越来越重要。干旱胁迫对玉米根系的生长发育、籽粒产量和品质都有较大影响，干旱胁迫抑制了玉米植株根系的生长，导致产量降低、品质变差。因此有关玉米干旱胁迫与抗旱性机理及其应用的研究才更加迫切，培育耐旱抗旱的玉米品种才是促进干旱和半干旱地区玉米生产发展的有效措施，同时也是抵御干旱提高产量的有效途径。

ASR（abscisic acid，stress，ripening） 蛋白是一类亲水性小分子量的植物特异性蛋白。ASR基因在植物响应发育和环境信号中发挥着重要的作用，包括衰老、果实成熟、花粉成熟和葡萄糖代谢[2-5]。并且ASR基因在ABA诱导和响应生物及非生物胁迫时显著上调[6-11]。大蕉ASR基因MpAsr受镰刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）诱导而上调表达[10]。ASR基因还可以影响果实的产量，玉米ASR基因（ZmASR1）的异位表达对玉米产量有很大的影响，这种影响并不受缺水胁迫条件的限制，ZmASR1通过调节支链氨基酸的生物合成基因可能有助于改善玉米的产量[12]。

由于ASR基因在拟南芥中不存在[9，13]，对其功能和调控机制的研究非常有限。有研究表明小麦转录因子基因TaASR1转入烟草之后通过激活体内的抗氧化系统和胁迫相关基因的表达来赋予其抗旱性[14]。Ricardi等在番茄中通过ChIP-SEQ技术证明番茄ASR1基因可能通过调控番茄细胞壁和水通道蛋白相关靶基因的表达来赋予番茄对干旱胁迫的耐受性[15]。前期的研究证明[12]，在玉米中ASR家族有9个成员，是目前ASR成员最多的品种，在玉米ASR基因家族9个成员中，在干旱胁迫条件下ZmASR1无论在转录水平还是蛋白质组水平上都是表达量最大、变化最为明显的，并且ZmASR1在玉米中的过量表达可以提高玉米在缺水胁迫下的籽粒产量，但是却没有对ZmASR1缺水胁迫下的调控机理进行更深入的研究，因此我们选择ZmASR1来进行抗旱调控机理的研究更有针对性和目的性。在玉米自交系中过表达ZmASR1基因是研究ZmASR1基因在植物中如何发挥调控作用的有效途径，对于培育玉米抗旱新品种，促进玉米产业的健康发展具有重要的理论和实践意义。

要想在玉米自交系中过表达ZmASR1基因，首先要构建植物表达载体，随着植物基因工程技术的发展，我们不仅要把特定的外源基因转入受体植物，更要将外源基因特定而高效地表达才能满足我们的需求。启动子序列中包含许多重要的顺式作用元件，对植物基因的表达水平具有重要作用，使其成为表达调控的关键环节。一般认为CaMV35S启动子在双子叶植物的遗传转化应用广泛，但在单子叶植物中的活性较低。而Ubiquitin启动子来自于玉米多聚泛素蛋白基因，是一个在单子叶植物中有较强表达的组成型启动子，在胁迫条件下，Ubiquitin基因的表达活性会显著增强[16]。本研究从玉米自交系B73中克隆了Ubiquitin启动子和玉米ZmASR1基因，构建了同时含Ubiquitin启动子和ZmASR1基因的植物表达载体，为后续获得转基因抗旱株系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

植物材料为玉米自交系B73，菌株为大肠杆菌DH5α和植物表达载体为pCAMBIA3301，农杆菌菌株为GV3101，酶与试剂为快速限制性内切酶 BamHⅠ、HindⅢ、PmlⅠ购自Thermo Scientific公司，T4 DNA 连接酶，pMD18-T vector （simple）均购自TaKaRa公司。