黄芩苷对大鼠血清孕酮水平的调控及其对脑缺血后神经功能的影响

刘锦林 潘彦舒 李海燕 程晓娜 王东辉 牟天龙 刘元

摘要：目的 观察黄芩苷对脑缺血雌性大鼠血清孕酮及其相关激素水平的影响，探讨其是否通过调控孕酮水平发挥对脑缺血大鼠神经功能的保护作用。方法 应用阴道涂片方法选取成年动情期雌性大鼠，随机分为正常组、正常+黄芩苷组和造模组。造模组制作左侧大脑半球永久性大脑中动脉栓塞模型，成模后随机分为模型组、黄芩苷组、孕酮组和孕酮抑制剂组。正常+黄芩苷组和黄芩苷组腹腔注射黄芩苷溶液，正常组和模型组腹腔注射等量生理盐水，孕酮组给予黄体酮注射液肌注，孕酮抑制剂组给予黄芩苷溶液腹腔注射和米非司酮溶液灌胃。分别于造模后不同时间点抓力测定仪检测各组大鼠前肢抓力，并进行神经功能行为评分；ELISA检测血清孕酮及其相关激素的水平。结果 与正常组比较，造模各组大鼠神经功能发生损伤，各时间点神经功能行为评分均极显著升高（P<0.001），各时间点前肢抓力均极显著降低（P<0.001）。治疗5 d，黄芩苷组显示出对神经功能改善的趋势（P>0.05），并可显著提高前肢抓力（P<0.01）；治疗10 d，黄芩苷组显著改善神经功能行为评分（P<0.05），并极显著提高大鼠前肢抓力大小（P<0.001）；与黄芩苷组比较，孕酮抑制剂组第10日对神经功能恢复有显著的抑制作用（P<0.05），第5、10日对抓力恢复亦有较显著的抑制作用（P<0.05）。同时，与模型组比较，黄芩苷组孕酮水平显著升高（P<0.05），促卵泡激素和促黄体生成素水平有所下降（P>0.05）。结论 应用米非司酮对孕酮进行阻断后，黄芩苷的神经功能保护作用显著受到抑制，提示黄芩苷可能通过上调血清孕酮水平而发挥脑保护作用。

关键字：黄芩苷；脑缺血；血清孕酮；神经功能；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.07.017

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）07-0065-05

Regulation of Baicalin for Serum Progesterone Level and Its Effects on Neural Functions after Cerebral Ischemia in Rats LIU Jin-lin1， PAN Yan-shu1， LI Hai-yan1， CHENG Xiao-na1， WANG Dong-hui1， MU Tian-long2， LIU Yuan3 （1. College of Preclinical Medicine， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China； 2. Dongfang Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100078， China； 3. 302 Military Hospital of China， Beijing 100039， China）

Abstract： Objective To investigate the effects of baicalin on serum progesterone and related hormones in female normal and cerebral ischemia rats； To explore whether baicalin plays a role in cerebral protection of neurological functions by regulating progesterone levels. Methods With vaginal smear method， the adult estrus female SD rats were selected and divided into normal group， baicalin normal group， and molding groups. The left side of the middle cerebral artery of rats in the molding groups was blocked to establish the permanent middle cerebral artery occlusion （pMCAO）. After modeling， the rats were randomly divided into model group， baicalin treatment group， progesterone treatment group and progesterone inhibitor group. The baicalin normal group and baicalin treatment group were given intraperitoneal injection of baicalin solution； the normal group and model group were given normal saline of the same quantity； progesterone treatment group was given intramuscular injection of progesterone； progesterone inhibitor group was given intraperitoneal injection of baicalin solution and intragastric administration of mifepristone solution.

基金项目：国家重点基础研究发展计划（2012CB518602）；国家自然科学基金青年基金（81202832）

通讯作者：潘彦舒，E-mail：13911209998@163.com

The neurological function deficit scores were evaluated and rat forelimb holding power was detected by Grip Strength Meter respectively at different time points. Serum was taken from the rats and the progesterone and related hormones levels in the serum of every group were measured by ELISA. Results Compared with normal group， neurological functions of rats in molding groups were damaged， and neural functional behavior scores of different time points were the most strongly increased （P<0.001）， and rat forelimb holding power was the most strongly reduced （P<0.001）. 5 days after treating， baicalin showed the trend of improvement of neurological functions （P>0.05） and more significant improvement of the forelimb holding power （P<0.01）； 10 days after modeling， baicalin treatment group significantly increased neural functional behavior scorce （P<0.001） and the most significantly improved the forelimb holding power （P<0.001）. Compared with baicalin treatment group， the progesterone inhibitor group had a significant inhibitory effect on neural functional recovery （P<0.05） 10 days after modeling， and the group also had a significant inhibitory effect on the recovery of holding power （P<0.05） 5 days and 10 days after treating. At the same time， compared with the model group， progesterone level in baicalin treatment group increased significantly （P<0.05）， and FSH and LH decreased （P>0.05）. Conclusion After applying mifepristone to block progesterone， baicalin neurologic protection is significantly inhibited. The results demonstrated that baicalin may play a role in cerebral protection via up-regulating serum progesterone level.

Key words： baicalin； cerebral ischemia； serum progesterone； neurologic function； rats

脑血管疾病是当今社会严重危害人类健康的常见病和多发病，亦是导致死亡和残障的主要原因之一，缺血性脑卒中是最常见的脑卒中类型，占全部脑卒中的80%左右[1]。目前国内外有关孕酮在脑缺血治疗方面的基础研究较为成熟，并已经明确了其对脑缺血或者脑外伤的神经保护作用[2]。然而，由于孕酮的不良反应阻碍了其在临床上的广泛应用，因此寻找孕酮的天然替代药物治疗脑缺血损伤具有较好前景。

黄芩具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎等功效，其主要成分黄芩苷对脑缺血具有良好的治疗效果，在清开灵注射液的相关研究中也得到证实[3-4]；同时有研究表明，黄芩苷可调节体内孕激素的水平[5]。本实验采用大鼠大脑中动脉栓塞（MCAO）模型，观察黄芩苷对血清孕酮（P）、促卵泡激素（FSH）和促黄体生成素（LH）水平以及脑缺血损伤大鼠神经功能的影响，初步推测黄芩苷是否通过调节P水平发挥对脑缺血的治疗作用，为后续的研发工作奠定基础。

1 实验材料

1.1 动物

雌性健康SPF级SD大鼠46只，12周龄，体质量（220±20）g，北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京）2012-0001。饲养于北京中医药大学实验动物中心，室温24 ℃、湿度50%，明暗交替12 h/12 h，室内风速控制在0.1～0.2 m/s。适应性饲养1周，术前禁食12 h，保留水供应。

1.2 药物及制备

黄芩苷，成都曼斯特生物科技有限公司，批号MUST-15062716，纯度98.59%；黄体酮注射液，浙江仙琚制药股份有限公司，规格20 mg，批号20150124；米非司酮，湖北葛店人福药业有限责任公司，规格25 mg，批号150301。黄芩苷溶液配制：将黄芩苷粉末用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.0）配制成7.5 mg/mL黄芩苷溶液，用2倍生理盐水稀释；米非司酮溶液配制：将米非司酮片碾成粉末状，溶于纯芝麻油，配制成1.302 mg/mL米非司酮溶液。

1.3 主要试剂与仪器

大鼠P、FSH和LH ELISA试剂盒，北京华英技术研究所，批号均为20151215；PBS，Solarbio，批号20150626；美蓝，国药集团化学试剂有限公司，批号20141104。4.5 g电子分析天平（AE160 型，瑞士Mettler公司），手术显微镜（SXP-1B，上海医用光学仪器厂），高频小电刀（1411型，上海医疗器械技术公司），低温高速离心机（xiangyi L-550，Sigma公司），光学显微镜（CH型，日本Olympus公司），抓力测定仪（47200型，Ugo Basile公司）。

2 实验方法

2.1 动情周期检测

2.1.1 性周期判定标准 参照文献[6]大鼠性周期阴道涂片细胞变化特点划分大鼠性周期的各阶段：①动情前期：持续时间17～21 h，涂片可见大量有核上皮细胞、少量角化上皮细胞；②动情期：持续时间9～15 h，涂片可见满视野角化上皮细胞、少量有核上皮细胞；③动情后期：持续时间10～14 h，涂片可见角化上皮细胞及白细胞；④动情间期：持续时间为60～70 h，涂片可见大量白细胞及少量黏液。

2.1.2 大鼠阴道涂片方法 参照文献[7]于每日8：00进行检测，连续4～5 d。将消毒细棉签用生理盐水湿润，轻轻插入大鼠阴道内，慢慢转动两下取出，把带有阴道黏液的棉签在载玻片上均匀转动做成涂片，酒精灯烘干后，用碱性美蓝溶液染色5 min，用蒸馏水冲去多余染液，显微镜观察，并根据大鼠阴道涂片细胞变化明确大鼠所处的性周期阶段。将动情周期规律的大鼠列为实验对象。

2.2 造模

继续观察列为实验对象大鼠的动情周期，每只大鼠均在其处于动情期时造模。参照文献[5]方法制作大鼠左侧大脑半球永久性MCAO模型。10%水合氯醛溶液大鼠腹腔注射麻醉，常规消毒，颈部正中切口，结扎左侧颈外动脉（ECA）远心端，电断ECA，由ECA残端剪口插入栓线，阻断大脑中动脉，用缝合线结扎ECA残端，剪断多余栓线，术区使用青霉素粉少许，逐层缝合手术切口。

2.3 分组及给药

按Bederson等[8]神经功能评分法将造模后的大鼠随机分为模型组（6只）、黄芩苷组（10只）、孕酮组（8只）和孕酮抑制剂组（简称抑制剂组，10只），另将处在动情期的正常大鼠分为正常组（6只）和正常+黄芩苷组（6只）。黄芩苷组和正常+黄芩苷组大鼠腹腔注射15 mg/kg黄芩苷溶液，正常组和模型组腹腔注射等量生理盐水，孕酮组肌肉注射8 mg/kg黄体酮，抑制剂组腹腔注射15 mg/kg黄芩苷溶液并予2.604 mg/kg米非司酮溶液灌胃。各组均于术后24 h给药，此后每日同一时间点给药。

2.4 检测方法及观察指标

2.4.1 神经功能行为评分 参照文献[8]方法，总分为10分。①提起鼠尾，观察右前肢表现。1分：内收，但不贴身；2分：内收，贴于身体；3分：内收贴于身体并踡缩；4分：大鼠躯体向右侧旋转。②将动物置一金属网上，向后轻提鼠尾，观察两侧前肢肌张力。0分：两侧前肢紧拉金属网肌力无明显差异；1分：右前肢拉金属网但肌力明显弱于左侧；2分：右前肢不能拉金属网。③将动物置光滑平面上，观察侧向推挡阻力。0分：双侧推挡阻力无明显差异；1分：右侧推挡阻力明显弱于左侧；2分：右推大鼠时其向右侧倾倒。④大鼠左眼上睑下垂，左眼分泌物增多者评2分。以上4项评分相加为最后神经功能评分。

2.4.2 抓力测定 分别于术后6 h和1、5、10 d，采用抓力测定仪检测各组大鼠的抓力。大鼠放置光滑平台上，前肢抓扶于抓竿上，大鼠在被牵拉尾部向后移动时会本能地抓住任何物体以阻止后退，直到拉力超过其抓力。大鼠失去抓力后，与其相连接的主仪器自动记录抓力的最大值，重复测量3次，记录大鼠前肢最大抓力。大鼠造模前对其进行第1次抓力测定，以造模前抓力值为基值，计算造模后不同时间点自体抓力变化。抓力变化=造模后抓力值÷造模前抓力值。

2.4.3 大鼠血清孕酮、促黄体生成素和促卵泡激素含量测定 造模后第10日，按照0.35 mL/100 g体质量大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉，自腹主动脉采血，静置2 h后，3000 r/min离心15 min，取血清冻存备用。ELISA检测血清P、LH和FSH含量，严格按照试剂盒说明操作。

3 统计学方法

采用SPSS21.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，数据资料经正态性分布检验及方差齐性检验后，采用方差分析或非参数检验比较组间差异。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 黄芩苷对模型大鼠神经功能行为评分的影响

与正常组比较，造模后大鼠存在神经功能缺损，各时间点差异均有统计学意义（P<0.001）；各组术后1 d大鼠神经功能缺损均有所加重，与模型组比较，术后5 d黄芩苷组大鼠神经功能出现恢复的趋势（P>0.05），术后10 d显著恢复（P<0.05）；术后5 d孕酮组大鼠神经功能出现恢复的趋势（P>0.05），术后10 d显著恢复（P<0.05）；黄芩苷组和孕酮组比较差异无统计学意义（P>0.05）；与黄芩苷组比较，术后10 d抑制剂组疗效受到显著抑制（P<0.05）。结果见表1。

组比较，△P<0.05

4.2 黄芩苷对模型大鼠前肢抓力变化的影响

与正常组比较，造模后大鼠前肢抓力降低，各时间点差异均有统计学意义（P<0.001）；与模型组比较，术后5 d黄芩苷组大鼠前肢抓力开始显著恢复（P<0.01），术后10 d极显著恢复（P<0.001）；术后5 d孕酮组大鼠前肢抓力开始显著恢复（P<0.01），术后10 d极显著恢复（P<0.001）；黄芩苷组与孕酮组比较差异无统计学意义（P>0.05）；与黄芩苷组比较，术后5、10 d抑制剂组抓力恢复均受到较显著的抑制（P<0.05）。结果见表2。

比较，△P<0.05

4.3 黄芩苷对模型大鼠血清孕酮、促黄体生成素和促卵泡激素水平的影响

与正常组比较，正常+黄芩苷组P水平有增加的趋势，LH水平有所下降，FSH水平亦略有下降，差异均无统计学意义（P>0.05）；与模型组比较，黄芩苷组P水平显著升高（P<0.05），LH水平有所下降，FSH水平亦略有下降，差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表3。

5 讨论

P为脂溶性甾体激素，是在神经系统中合成的神经活性甾体，除可在外周内分泌腺（肾上腺和性腺等）合成，也存在于人脑中。现已证实，在急性中枢神经系统损伤、创伤性脑外伤、脊髓损伤、脑卒中等大鼠模型中，P可减轻脑水肿、减少炎症级联反应，P产生的代谢物能减少促凋亡酶和增加抗凋亡酶、加速神经髓鞘修复等[9-11]。尽管P治疗脑缺血疾病的疗效肯定，而且在基础研究和Ⅰ期、Ⅱ期临床研究均比较成熟，然而其不良反应也日益显现，因此进入Ⅲ期临床研究面临困难，尚未在临床上展开应用。

在很多中药单体研究中，黄芩主要有效成分之一的黄芩苷药理作用研究取得了较大进展，主要包括抗氧化、抗菌抗病毒、抗炎、抗癌、抗过敏、抗心律失常、降压和镇静作用及对免疫消化神经等系统的保护作用[12-16]。预实验结果显示，与模型组比较，脑缺血第7日黄芩苷组大鼠神经功能评分、前肢抓力及死亡率等改善最为显著（P<0.01）。同时考虑到雌性大鼠的动情周期为5 d左右，因此选择在第3个动情期即第10日取材检测。本研究结果显示，脑缺血10 d时黄芩苷能显著改善大鼠神经功能评分，极显著恢复大鼠前肢抓力。

本实验选用雌性大鼠在动情期进行造模和取材，是考虑到激素水平在动情周期内的动情期孕激素水平较低，以减小自身激素水平引起的误差。研究结果显示，黄芩苷能增加正常大鼠和脑缺血大鼠血清P水平；对其负反馈调节的2种相关激素LH和FSH均略有下调，尤其是对LH的影响，这点与生理的反馈调节是相对应的。但受实验大鼠只数所限，这种差异趋势并不显著。

P在大鼠动情周期中有明显的周期性变化。这一变化与动情周期中黄体细胞的产生和消退密切相关。LH和FSH均为垂体前叶嗜碱性细胞分泌的糖蛋白激素，前者是促进卵巢的卵泡发育和成熟，后者主要是促使排卵，2种激素协同作用，形成黄体并分泌孕激素。卵巢性激素对下丘脑促性腺激素释放激素和垂体促性腺激素（包括LH和FSH）的合成和分泌具有反馈作用。排卵后，血液中雌激素和孕激素水平明显升高，两者联合作用，FSH和LH的合成和分泌又受抑制。其中P的分泌与LH的关系最密切。有研究表明，LH峰的出现可激活卵泡膜中腺苷酸环化酶，导致腺苷酸环化酶增加，腺苷酸环化酶引起颗粒细胞黄体化，使卵泡内的P含量增加，从而抑制促进LH分泌的雌激素正反馈作用[17]。

米非司酮为受体水平抗孕激素药物，具有终止早孕、抗着床、诱导月经及促进宫颈成熟等作用，与P竞争受体而达到拮抗P的作用。应用米非司酮对P进行阻断后，黄芩苷的神经功能保护作用显著受到抑制。提示黄芩苷可能是通过上调血清P水平而发挥脑保护作用的。

综上，本实验结果显示，黄芩苷对雌性大鼠局灶性脑缺血具有保护作用，其作用机制可能与上调血清P水平有关。黄芩苷已经应用于临床其他疾病的治疗，鲜有应用于脑缺血治疗的临床报道，本课题的研究意义在于解决P的临床推广难题，为寻求P的天然替代药物奠定基础。

参考文献：

[1] 段云霞，陈小玉，张梓倩，等.缺血性脑卒中治疗药物研究进展[J].中央民族大学学报：自然科学版，2012，21（2）：65-70.

[2] STEIN D G， WRIGHT D W， KELLERMANN A L. Does progesterone have neuroprotective properties？[J]. Annals of Emergency Medicine， 2008，51（2）：164-172.

[3] 朱晓磊.精制清开灵抗实验性脑缺血的血管保护机制研究[D].北京：北京中医药大学，2006.

[4] 钟相根，李澎涛，王永炎，等.清开灵有效组分对大鼠缺血脑组织星形胶质细胞活化的影响[J].中国医药学报，2004，19（6）：338-340.

[5] 陈婷.黄芩苷对小鼠子宫组织经典Wnt通路相关物质表达的影响[D]. 武汉：华中农业大学，2013.

[6] 邹移海，徐志伟，苏钢强.实验动物学[M].北京：科学出版社，2004：84.

[7] 王秋玲.散结乳癖膏对卵巢囊肿大鼠血清中雌激素、孕激素含量影响的研究[D].哈尔滨：黑龙江中医药大学，2013.

[8] LONGA E Z， WEINSTEIN P R， CARLSONS S， et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke， 1989，20（20）：84-91.

[9] SCHUMACHER M， GUENNOUN R， STEIN D G， et al. Progesterone：therapeutic opportunities for neuroprotection and myelin repair[J]. Pharmacology & Therapeutics，2007，116（1）：77-106.

[10] VANLANDINGHAM J W， CEKIC M， CUTLER S， et al. Neurosteroids reduce inflammation after TBI through CD55 induction[J]. Neuroscience Letters，2007，425（2）：94-98.

[11] DJEBAILI M， HOFFMAN S W， STEIN D G. Allopregnanolone and progesterone decrease cell death and cognitive deficits after a contusion of the rat pre-frontal cortex[J]. Neuroscience， 2004， 123（2）：349-359.

[12] 李湘潋.靶向禽流感H5N1包膜蛋白进入抑制剂的筛选及机制研究[D].广州：南方医科大学，2013.

[13] 康辉，李强，王丽.黄芩提取物、黄芩苷抗氧化和保肝作用研究[J]. 中医研究，2010，23（4）：27-30.

[14] 韩宝瑞.黄芩苷结构修饰及抗氧化构效关系[J].食品科学，2011， 32（1）：49-51.

[15] 王娜.黄芩苷对肝癌细胞Cx26及Cx43表达的影响[D].石家庄：河北医科大学，2012.

[16] GLIONKE W， HAUSMANN E， BERGMANN L. Downregulation of STAT3 signaling induces apoptosis but also promotes anti-apoptotic gene expression in human pancreatic cancer cell lines[J]. Tumor Biology，32（3）：493-500.

[17] 郑月慧，况海斌，钟志胜，等.大鼠动情周期及妊娠期卵巢c-myb表达的变化[J].基础医学与临床，2001，21（5）：424-427.

（收稿日期：2016-01-25）

（修回日期：2016-02-14；编辑：华强）