β2肾上腺素能受体基因Arg16Gly和Gln27Glu多态性与高海拔地区藏族人群原发性高血压的相关性研究

李星辉，乔燕，马玉安，齐文华，李彩霞，李宝鹃



β2肾上腺素能受体基因Arg16Gly和Gln27Glu多态性与高海拔地区藏族人群原发性高血压的相关性研究

李星辉，乔燕，马玉安，齐文华，李彩霞，李宝鹃

摘要

目的: 检测高海拔地区藏族人群β2肾上腺素能受体（β2-AR）基因Argl6Gly和Gln27Glu多态性，并研究其与原发性高血压的相关性。

方法：选择原发性高血压患者（原发性高血压组）385例及正常对照（对照组）297例为研究对象，通过SNaPshot微测序技术测定其基因型和等位基因，对在两组人群中的频率分布进行对比。

结果: β2-AR基因Argl6Gly和Gln27Glu多态性的基因型和等位基因频率原发性高血压组和对照组间比较差异无统计学意义（P＞0.05），进一步进行不同性别人群间的对比分析，差异亦无统计学意义（P＞0.05）。

结论：未观察到β2-AR基因Argl6Gly和Gln27Glu多态性与高海拔地区藏族人群原发性高血压的相关性。

关键词 受体, 肾上腺素能β2 ；基因；高血压；藏族

Objective: To investigate β2 adrenergic receptor (β2-AR) gene polymorphism, Arg16Gly, Gln27Glu and essential hypertension (EH) occurrence in Tibetan population living at high altitude area.

Methods: Our research included in 2 groups: EH group, n=385 patients and Control group, n=297 normal healthy subjects. β2-AR polymorphisms of Arg16Gly and Gln27Glu were detected by Snapshot mini-sequencing technique and their frequencies were compared between 2 groups and male, female genders.

Results: The genotype and allele frequency distributions of Arg16Gly and Gln27G1u were similar between 2 groups, P＞0.05; there were no significant differences between male and female genders, P＞0.05.

Conclusion: No obvious relationship was found between β2-AR gene polymorphism (Arg16Gly, Gln27Glu) and EH occurrence in Tibetan population living at high altitude area.

Key words Receptors, adrenergic, beta-2; Gene; Hypertension; Tibetan

(Chinese Circulation Journal, 2016, 31:372.)

高血压发病与遗传因素和环境因素有关，大约25%～40%的血压升高程度与遗传基因相关[1]。到目前为止，有200多个基因被列为原发性高血压候选基因，近年来研究较多的原发性高血压易感性有肾素—血管紧张素—醛固酮系统（RAAS）、交感神经系统、细胞膜离子转运系统等基因[2]。但诸多文献显示，这些相关基因的单核苷酸多态性（SNPs）与原发性高血压的关系，不同种族、不同人群研究结果不尽相同，存在较多差异,争议较多，因此值得进一步深入分析探讨。在原发性高血压候选基因识别研究中，β2肾上腺素能受体（β2-AR）基因是较受重视的一个候选基因。近年来尽管国内外已在这方面进行了一些研究，但结果不一，提示不同种族和人群该基因SNPs的分布及其在原发性高血压的发病机制中所起的作用存在差异[3，4]。鉴于遗传背景对遗传性疾病发病的影响，我们选择地处我国西北甘肃省高海拔少数民族地区藏族人群作为研究对象，采用病例—对照基础上的关联分析研究,即以确诊的原发性高血压患者作为病例,以不患有该病但具有可比性的个体作为对照,应用SNaPshot技术比较原发性高血压组与对照组中各基因型和等位基因的频率和差异,以期探讨此基因多态性与这一人群原发性高血压发生发展的关联性。

1 资料与方法

研究对象：2014-03至2014-10，采用随机、分层、整群抽样的方法,对甘肃省甘南藏族自治州2个城区、8个农村定居地区的18岁以上人群进行横断面流行病学调查。在10个抽样地区的医疗机构单位共调查18岁以上藏族成人682例，其中原发性高血压患者（原发性高血压组）385例，正常对照（对照组）297例。所有研究对象为世居高原地区人群，两组之间无亲缘关系，无异族通婚史。本研究前期通过甘肃省人民医院伦理委员会批准，调查获得当地政府同意，所有受调查者均签署了知情同意书。

血压测量：采用经核准的水银柱血压计测量右臂坐位血压共3次。测量前30 min, 要求调查对象不能饮酒、吸烟、饮咖啡或茶及进行较为剧烈的活动,休息5 min 后测量血压。原发性高血压组患者排除继发性高血压、心肌病、心脏瓣膜病、先天性心脏病、糖尿病、肝和肾功能疾患等，均符合2010年中国高血压防治指南的高血压诊断标准[5]。对照组为从未接受过降压治疗并且静息时收缩压＜140 mmHg （1 mmHg=0.133 kPa）和舒张压＜90 mmHg者,无高血压家族史，同样排除了上述疾患，性别、年龄均基本匹配。被调查者采血前8～14 h禁食，晨间采取坐位肘部静脉血5 ml，标本采取后存放至随身携带的冷藏包内，后用当地疾控中心冷链车运送至同一实验室进行测定，进行DNA提取及检测。

基因型测定：本次实验采用SNaPshot技术也称微测序技术对β2-AR Argl6Gly（rs1042713）和Gln27Glu（rs1042714）多态位点进行了检测。从GENBANK中获取人类β2-AR编码基因，并获得位点信息。根据以上信息位点设计两个引物，上游引物：5’-ATGAGGCTTCCAGGCGTC-3’，下游引物：5’-GATGAGAGACATGACGATGCC-3’（上海生物工程有限公司合成）。聚合酶链反应（PCR）体系20 μl，其中含有1.0 μl的基因组DNA、10×buffer 2.0 μl、50 mmol/L MgCI 20.8 μl、脱氧核苷三磷酸（dNTP） 0.5 μl、PCR引物1.0 μl、Platinum Taq聚合酶0.2 μl。PCR循环参数为：预变性95℃ 2 min后，继之进行35个循环，每个循环95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，最后72℃ 持续5 min延伸。后取2.0 μl PCR扩增产物用ExoI酶和虾碱性磷酸酶（SAP）纯化，主要是用ExoI去除反应产物中的剩余引物，用SAP去除反应中剩余的dNTP。SNP分型利用1.0 μl上述纯化延伸产物，与GenescanTM-120LIZ Size Standard 0.5 μl和去离子甲酰胺8.5 μl混合均匀后,95℃变性5 min，ABI3730测序仪进行分型。收集的原始数据用Gene Mapper4.0 （Applied Bio systems Co.Ltd.USA）分析。

统计学处理：采用SPSS18.0统计软件进行分析。所有计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组均数间比较采用t检验，分类资料用构成比和率描述，用直接计数法分别计算对照组和原发性高血压组基因型频率,由基因型频率计算等位基因频率；各组基因型、等位基因分布频率比较采用χ2检验，用Hardy-Weinberg平衡定律检验样本的群体代表性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

原发性高血压组与对照组的基线资料比较（表1）： 原发性高血压组体重指数、收缩压、舒张压均高于对照组（P均＜0.05）。

表1 原发性高血压组与对照组基线资料比较（±s）

基因型分布的Hardy-Weinberg平衡检验（表2）: 本人群原发性高血压组、对照组的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡（P＞O.05），遗传学上该样本可代表藏族人群。

表2 β2-AR基因Argl6Gly和Gln27Glu多态性基因型频率的比较（%）

PCR扩增结果及SNaPshot基因分型结果：图1所示为β2-AR基因Argl6Gly、Gln27Glu PCR扩增结果，扩增片段的长度为230 bp。图2所示为β2-AR基因Arg l6Gly、Gln27Glu SNaPshot基因分型结果，延伸产物碱基的对应颜色A：绿色，G：蓝色，C：黑色，Argl6Gly（rs1042713）基因型分别为AA、AG、GG，Gln27Glu（rs1042714） 基因型分别为GG、GC、CC。

图1 β2-AR基因Argl6Gly、Gln27Glu PCR扩增结果

图2 β2-AR基因Argl6Gly、Gln27Glu SNaPshot基因分型结果

β2-AR基因多态性同藏族原发性高血压的相关性分析：SNaPshot分析Arg16Gly原发性高血压组332例、对照组257例成功，Gln27Glu原发性高血压组336例、对照组260例成功。结果提示Arg16Gly和Gln27Glu的基因型频率在藏族原发性高血压组和对照组中的分布差异无统计学意义（P＞0.05），等位基因频率分布差异亦无统计学意义（P＞0.05）（表3）。按性别进行分层分析发现，差异仍无统计学意义（P＞0.05）（表4）。

表3 两组β2-AR基因Argl6Gly和Gln27Glu基因型和等位基因频率比较[例（%）]

表4 不同性别两组β2-AR基因Argl6Gly和Gln27Glu基因型和等位基因频率比较[例（%）]

3 讨论

1987年, Kobilka等[6]首先发现并发表了β2-AR基因全序列，该基因定位于染色体5q31-5q32区域,无内含子,编码区包含1239个碱基对,编码413个氨基酸。近年来，随着心血管疾病研究的深入，β2-AR基因多态性位点陆续被发现, 迄今研究最多的为+46位核苷酸由腺嘌呤（A）转化为鸟嘌呤（G），使其编码的第16位的精氨酸（A）变为甘氨酸（T），即A46G突变；+79位核苷酸由鸟嘌呤（G）为胞嘧啶（C）所取代，使编码第27位的谷氨酰胺（G）变为谷氨酸（M），即G79C突变。关于β2-AR基因16、27位点多态性与原发性高血压的关系国外报道不一。Kotanko等[3]对加勒比海地区非洲人后裔的研究中认为β2-AR基因Glyl6等位基因可能为原发性高血压的易感等位基因, Busjahn等[7]发现Argl6等位基因与原发性高血压相关。但Candy等[8]以南非黑人为对象，未发现原发性高血压与β2-AR基因Argl6Gly多态性有关。我国一项对北方汉族人群的研究中，Ge等[9]测定了503例2级高血压患者及504名正常血压者的β2-AR Arg16Gly基因型，结果显示在此高血压人群内Gly16存在频率很高。吴弘等[10]分别报道了β2-AR与中国大别山、安徽地区汉族人群原发性高血压的关系，其中Argl6Gly SNP在正常血压和原发性高血压人群中的分布有显著性差异，提示其可能与原发性高血压相关联。Bray等[11]发现原发性高血压组Glu27等位基因明显高于对照组。而Yu等[12]和朱敏等[13]的研究未显示Gln27/Glu多态性与原发性高血压有相关性。本研究以甘肃甘南藏族自治州藏族人群为研究对象，结果显示Argl6Gly、Gln27Glu基因型和等位基因在原发性高血压组和对照组中的构成比较差异无统计学意义，提示两位点多态性与藏民族原发性高血压无相关性。进一步研究发现，藏族男女性人群Argl6Gly、Gln27Glu位点多态性与高血压发病均无相关性。

β2-AR通过激活环磷酸腺苷（cAMP）依赖性的蛋白激酶A和其他信号传导通路，调节许多生理性和代谢性的过程，包括心率、血压、肾脏的水、钠排泄和潴留等[11]。β2-AR多态性是血管应激反应的主要决定因素，但关于其多态性与高血压相关性未得出统一结论，研究结果之间的分歧提示原发性高血压在不同种族可能具有不同的发病机理。目前该基因位点在低海拔地区汉族人群中多有相关报道。流行病学研究表明原发性高血压的患病率在我国各地区、民族之间差别很大，生活在北方或高原地区的藏族、蒙古族和朝鲜族等患病率较高，而生活在南方或非高原地区的壮族、苗族和彝族等患病率则较低[5]。本研究人群为居住在海拔高度3000米左右的甘肃省甘南藏族自治州，地理位置偏远，人口迁徙较小，遗传背景较单一，样本同质性较好，分析效能可信度高，可为研究这些人群原发性高血压发病方面提供理论依据。

SNaPshot技术也称微测序技术，可同时进行多达几十个SNPs的检测，准确性高，检测速度快，成本低廉，目前，已经广泛地用于人类疾病相关性分析。本研究通过此技术初步分析了甘肃高海拔地区藏族β2-AR基因Argl6 Gly、Gln27Glu位点多态性与原发性高血压的相关性。研究结果提示：此基因上述两位点多态性可能不是此地区藏族原发性高血压的遗传标志。当然原发性高血压的遗传规律复杂，受多种因素影响，研究结果差异分析原因可能不仅是由于种族、地域等环境因素的不同，而且位点之间存在连锁不平衡，病例对照的严格选择以及样本量的大小也会影响统计结果的准确性。本研究人群具有自己独特的宗教风俗和民族习惯等，在收集资料及采集血样时部分人群不能良好配合，农牧地区尤其明显，因此样本量相对偏少。今后研究中如能扩大样本量，通过大规模、高质量、多位点、多基因间的联合研究，相信结果会更有说服力。

参考文献

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[2] 侯嵘, 刘治全. 原发性高血压相关基因研究进展. 中国循环杂志, 2000, 15: 252-253.

[3] Kotanko P, Binder A, Tasker J, et al. Essential hypertension in african caribbeans associated with a variant of the 2-adrenoceptor．Hypertension, 1997, 30: 773-776.

[4] Ranade K, Shue WH, Hung YJ, et a1. The glycine allele of a glycine/ arginine polymorphism in the Beta(2)-adrenergie receptor gene is association with essential Hypertension in a population of Chinese origin. Am J Hypertention, 2011, 14: 1196-1200.

[5] 中国高血压防治指南修订委员会. 中国高血压防治指南2010. 中华心血管病杂志, 2011, 39: 579-615.

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[7] Busjahn A, Li GH, Faulhaber HD, et al. β2 adrenergic receptor gene variations, blood pressure, and hearty size in normal twins. Hypertension, 2000, 75: 556-560.

[8] Candy G, Sarnani G, Norton G, et al. Association analysis of beta-2 adrenoceptor polymorphisms with hypertension in a Black African population. J Hyperens, 2000, 18: 167-172.

[9] Ge D, Huang J, He J, et al. beta2-Adrenergic receptor gene variations associated with stage-2 hypertension in northern Han Chinese. Ann Hum Genet, 2005, 69(pt 1): 36-44.

[10] 吴弘, 蔡刚明, 陈华, 等. 高血压患者β2肾上腺素能受体基因编码区三个单核昔酸多态性研究. 中华心血管病杂志, 2001, 29: 198-202.

[11] Bray MS, Boerwinkle E. The role of beta(2)-adrenergic receptor variation in human hypertension．Curt Hypertens Rep, 2000, 2: 39-43.

[12] Yu SF, Zhou WH, Jiang KY, et a1．Job stress, gene polymorphism of beta2-AR, and prevalence of hypertension. Biomed Environ Sci, 2008, 21: 239-246．

[13] 朱敏, 门琛, 李健, 等. β2肾上腺素能受体多态性与原发性高血压的关系. 江苏医药, 2009, 35: 1281-1283．

（编辑：漆利萍）

Relationship Between β2-Adrenergic Receptor Gln27Glu Gene Polymorphism and Essential Hypertension Occurrence in Tibetan Population Living at High Altitude Area

LI Xing-hui, QIAO Yan, MA Yu-an, QI Wen-hua, LI Cai-xia, LI Bao-juan.
Department of Cardiology, Gansu Provincial Hospital, Lanzhou (730000), Gansu, China
Corresponding Author: QIAO Yan, Email: 13669336252@163.com

Abstract

作者单位：730000 甘肃省兰州市，甘肃省人民医院 心内科

作者简介：李星辉 副主任医师 博士 主要从事心血管内科基础与临床研究 Email：xinghui415@163.com 通讯作者：乔燕Email：13669336252@163.com

中图分类号：R54

文献标识码：A

文章编号：1000-3614（2016）04-0372-04

doi:10.3969/j.issn.1000-3614.2016.04.014

(收稿日期：2015-09-18)