ING5基因表达对胃癌细胞生长抑制作用的研究

杨雪峰，勾文峰，赵爽，申道福，吴亚州，李君君，郑华川

（锦州医科大学附属第一医院肿瘤实验中心，肿瘤基础与转化实验室，实验动物中心，辽宁 锦州 121001）



·论著·

ING5基因表达对胃癌细胞生长抑制作用的研究

杨雪峰，勾文峰，赵爽，申道福，吴亚州，李君君，郑华川

（锦州医科大学附属第一医院肿瘤实验中心，肿瘤基础与转化实验室，实验动物中心，辽宁 锦州 121001）

摘要目的探讨ING5基因表达对胃癌生长抑制作用。方法构建pEGFP⁃N1⁃ING5重组质粒，获得ING5高表达SGC⁃7901细胞株，分别通过CCK⁃8、流式细胞术、划痕、transwell、real⁃time PCR、Western blot、裸鼠成瘤实验、免疫组化检测并比较SGC⁃7901细胞与克隆细胞增殖率、周期与凋亡、迁移与侵袭、mRNA、裸鼠成瘤大小以及相关蛋白表达。结果与SGC⁃7901组及Mock组比较，转染pEGFP⁃N1⁃ING5后，胃癌SGC⁃7901细胞增殖显著抑制（P＜0.05），凋亡减少（P＜0.05），G1期比例增加，G2期比例下降（P＜0.05），迁移与侵袭能力减弱（P＜0.05），NF⁃κB、PI3K、p⁃Akt1/2/3、Bcl⁃2、XIAP、β⁃catenin、c⁃mycmRNA及蛋白表达水平均升高（P＜0.05）；Akt1/2/3、MMP9mRNA及蛋白表达降低（P＜0.05）。结论ING5基因表达降低胃癌SGC⁃7901细胞株增殖、减少凋亡、发生G1期阻滞、抑制其迁移与侵袭、有效调控增殖、周期、黏附相关基因与蛋白的表达，从而抑制胃癌的演进与发展。

关键词胃癌；ING5；肿瘤发生；基因治疗

网络出版地址

胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，抑癌基因功能的失活或降低在胃癌的发生发展中发挥重要作用［1］。生长抑制基因家族（inhibitor of growth family member，ING）包括5个家族成员。其中，ING5定位于人染色体2q37.3上，因其具有抑制细胞生长并以p53蛋白依赖方式诱导细胞凋亡的生物学作用，被认为是一种抑癌基因［2］。研究［3］表明，ING5过表达可以通过调节p53诱导结直肠癌细胞发生凋亡。研究［4］发现口腔鳞状细胞癌中ING5发生突变，其mRNA表达降低，揭示其肿瘤抑制作用。头颈部鳞状细胞癌组织芯片研究［5］提示ING5由核转移至细胞质可能是其致癌性与肿瘤演进的关键因素，ING5由核入细胞质后可能通过与p38MAPK和ME⁃KK4蛋白相互作用，从而参与细胞应激反应与DNA损伤。XING等［6］对于胃癌组织中ING5的分布与表达研究显示，胃癌中ING5mRNA表达增加，细胞核ING5蛋白含量低于细胞质。细胞核ING5表达与肿瘤大小、肿瘤侵润与转移、临床病理分期呈负相关，而细胞质ING5表达与肿瘤大小、肿瘤侵润与转移、临床病理分期呈正相关，说明ING5的定位对于胃癌的发生发展至关重要。

本实验通过构建pEGFP⁃N1⁃ING5重组质粒，获得ING5高表达SGC⁃7901细胞株，进而探讨ING5基因在胃癌SGC⁃7901细胞中的分子生物学功能。通过裸鼠体内成瘤实验，探讨ING5基因与胃癌发生发展之间的联系，从而为胃癌发病的分子机制与靶基因治疗提供一定实验依据。

1　材料与方法

1.1质粒构建

pCDNA3.1⁃ING5质粒由Côté教授惠赠［Laval University Cancer Research Center，Hôtel⁃Dieu de Québec（CHUQ），Québec City，Québec G1R 2J6，Can⁃ada］，与载体（pEGFP⁃N1）进行双酶切，酶切位点为BamHⅠ和HindⅢ，构建pEGFP⁃N1⁃ING5重组质粒。

1.2细胞培养

胃癌细胞系SGC⁃7901购自中国北京癌症研究所，用含10%胎牛血清的DMEM培养基，培养基中加入青霉素（100 mg/L）和链霉素（100 mg/L），细胞在饱和湿度、37℃、5%CO2浓度条件培养箱中培养，取状态良好处于对数生长期细胞用于实验。

1.3转染

SGC⁃7901细胞铺盘贴壁24 h后，转染pEGFP⁃N1⁃ING5质粒与pEGFP⁃N1空载体质粒，通过G418筛选单克隆细胞株，real⁃time PCR和Western blot鉴定ING5表达量，取ING5高表达克隆株用于后续实验。

1.4细胞增殖分析

SGC⁃7901与克隆株按2×104/mL密度接种于96孔板，每孔100 μL细胞悬液，待细胞贴壁后，选取0、24、48、72、96 h 5个时间点分别加入10 μL CCK⁃8，培养箱孵育3 h后450 nm检测吸光度，以时间为横坐标、增殖率为纵坐标绘制增殖曲线。

1.5细胞周期分析

SGC⁃7901与克隆株按2×105/mL密度接种于6 cm细胞培养盘，收集细胞弃去上清，PBS冲洗2次，加入1 mL预冷75%乙醇，-20℃过夜，加入RNase（0.25 mg/mL），37℃孵育30 min，加入PI至终浓度50 μg/mL，4℃避光孵育30 min，流式细胞仪检测。

1.6细胞凋亡分析

SGC⁃7901与克隆按2×105/mL密度接种于6 cm细胞培养盘，收集细胞以及上清液，PBS冲洗2次，严格按照试剂说明书加入7⁃AAD和PE⁃labeled an⁃nexin V（BD Pharmingen，USA）染料，1 h内流式细胞仪检测。

1.7细胞划痕实验

将SGC⁃7901与克隆株按1×106/mL接种于6孔板中，细胞贴壁后，用200 μL枪头划去单层细胞，PBS清洗2次，加入无血清培养基继续培养，选取0、24、48、72 h拍照，使用图像分析软件测量细胞迁移率。

1.8细胞迁移与侵袭分析

SGC⁃7901细胞消化后无血清培养基重悬，按2.5×105/mL密度接种于transwell小室（BD Biosci⁃ence）上层，下室加入含10%FBS培养基，侵袭实验还需在上室预先加入基质胶孵育4 h后接种细胞悬液。24 h后PBS清洗transwell小室，100%甲醇固定细胞，吉姆萨染色，镜下随机选取视野进行细胞计数。

1.9RT⁃PCR

提取细胞总RNA，按QIAGEN RNeasy mini kit（德国QIAGEN公司）说明书操作，逆转录酶avian myeloblastosis virus（AMV）和随机引物购自日本Ta⁃KaRa公司，real⁃time PCR使用SYBR Premix Ex TaqTMⅡkit（日本TaKaRa公司），引物序列、循环数、产物大小见表1。

1.10Western blot

所有抗体购于美国Santa cruz公司。提取各组细胞总蛋白并测定浓度。将各组蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿转2 h后5%脱脂奶粉室温孵育1 h，加入适量一抗，4℃反应过夜。二抗采用HRP标记的IgG，室温反应1 h，ECL⁃Plus试剂盒（Santa Cruz公司）发光显影检测目的蛋白。

1.11裸鼠成瘤实验

胰酶消化收集对数生长期细胞，PBS洗涤2次后，用无血清培养基重悬细胞，调整细胞密度为1× 106/mL，用1 mL注射器抽取上述细胞悬液200 μL，皮下接种于6～8周的BALB/C裸鼠腋下，每隔3 d观察裸鼠精神、饮食、体质量以及肿瘤生长情况。2～3周后用卡尺测量瘤体大小，肿瘤体积按长×宽×高× 0.52计算。处死裸鼠，分离皮下肿瘤，称取肿瘤重量，分析各组间肿瘤大小差异。取部分肿瘤4%甲醛固定，石蜡包埋，制备切片用于后续免疫组化实验。

表1　Real-time PCR引物Tab.1　The primer of real-time PCR

1.12免疫组化

制作病理切片，切片经过脱蜡、脱苯、抗原修复后，3%过氧化氢去掉内源性过氧化物酶，5%BSA室温封闭，加入适量一抗4℃过夜。TBST清洗后加入二抗室温孵育1 h，TBST清洗后DAB显色，苏木素复染。切片梯度乙醇脱水后二甲苯透明，树脂封片镜下观察拍照。

1.13统计学分析

2　结果

2.1ING5过表达对SGC⁃7901细胞恶性表型的影响

利用real⁃time PCR和Western blot检测转染pEGFP⁃N1⁃ING5后单克隆中ING5的表达。结果显示，转染后clone4和clone8中ING5mRNA和蛋白表达水平均增加（P＜0.05），见图1。通过CCK⁃8检测转染pEGFP⁃N1⁃ING5后胃癌细胞SGC⁃7901增殖的影响，结果显示与SGC⁃7901相比，ING5高表达克隆株可以有效抑制细胞增殖（P＜0.05，图2A）。应用PI细胞周期检测试剂盒与Annexin V/7⁃AAD凋亡检测试剂盒检测转染pEGFP⁃N1⁃ING5后对胃癌细胞SGC⁃7901周期凋亡的影响。结果提示，转染pEGFP ⁃N1⁃ING5后胃癌细胞SGC⁃7901发生G1期阻滞，细胞凋亡减少（P＜0.05，图2B、2C）。

通过划痕实验与transwell小室检测转染pEGFP⁃N1⁃ING5后细胞迁移、侵袭能力，结果显示，转染pEGFP⁃N1⁃ING5后胃癌SGC⁃7901细胞迁移和侵袭能力均下降（P＜0.05，图3A、3B）。

图1　ING5转染SGC-7901细胞单克隆筛选Fig.1　Screening of monoclonal ING5 transfectants

图2　ING5过表达对SGC-7901细胞增殖、周期与凋亡的影响Fig.2　The effect of ING5 expression on proliferation，cell cycle and apoptosis of SGC-7901 cells

Western blot结果显示转染pEGFP⁃N1⁃ING5后胃癌SGC⁃7901细胞NF⁃κB、PI3K、p⁃Akt1/2/3、Bcl⁃2、XIAP、β⁃catenin、c⁃myc、mRNA及蛋白表达均升高（P＜0.05）；Akt1/2/3、MMP9mRNA及蛋白表达降低（P＜0.05），见图4 A、4B。

2.2ING5过表达对裸鼠成瘤的影响

皮下注射胃癌细胞SGC⁃7901与转染细胞株clone 8，分离皮下肿瘤，测定瘤体大小与体积，结果显示，转染pEGFP⁃N1⁃ING5后胃癌SGC⁃7901细胞裸鼠成瘤能力减弱，SGC⁃7901组平均瘤体大小为（434.35±13.02）mm3，clone 8组平均瘤体大小为（22.56±6.72）mm3，显著抑制了瘤体大小（P＜0.05）。免疫组化ki67与TUNEL结果显示，转染pEGFP⁃N1⁃ING5后胃癌SGC⁃7901细胞瘤体增殖降低，凋亡减少（图5）。

3　讨论

ING基因家族是近年来发现的肿瘤抑制基因，它们广泛参与负性调节细胞增殖、促进凋亡、周期阻滞、并抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭［7］。在许多肿瘤中发现ING5蛋白功能丧失，氨基酸突变或者定位的改变［8］。研究［3］表明，ING5可促进p53的转录活性，上调p21WAF1、Bax等下游靶基因，从而抑制细胞增殖、诱导凋亡、发生周期阻滞。赵春阳等［9］检测到食管鳞状细胞癌组织ING5mRNA表达下调，可能与食管鳞状细胞癌的发生密切相关。路美玲等［10］发现在肝癌组织和肝癌细胞系中ING5mRNA和蛋白表达均下调，揭示其在肝癌的发生、发展中可能起到抑制作用。

本研究结果表明，ING5过表达可以上调PI3K mRNA以及蛋白的表达，从而调控其下游Akt1/2/3转化为磷酸化激活状态，然而ING5过表达可以活化NF⁃κB的表达，上调Bcl⁃2、XIAP进而抑制胃癌SGC⁃7901细胞凋亡，不利于抗肿瘤药物的治疗，这也可能是其耐药性的作用机制。此外，原癌基因c⁃myc表达升高，可能是ING5过表达调控SGC⁃7901细胞周期阻滞的机制。β⁃cateninmRNA以及蛋白的表达升高，提示ING5可能通过调节β⁃catenin进而介导细胞间黏附，下调胃癌SGC⁃7901细胞MMP9蛋白表达从而抑制胃癌细胞迁移与侵袭。体外动物实验显示，ING5表达可以有效抑制裸鼠体内肿瘤形成，抑制其增殖，同样抑制其凋亡，这与细胞实验结果一致，进一步说明ING5作为抑癌基因的双面性。

图3　ING5过表达对SGC-7901细胞迁移与侵袭的影响Fig.3　The effect of ING5 expression on migration and invasion of SGC-7901 cells

综上所述，抑癌基因ING5可以降低胃癌SGC⁃7901细胞株增殖、减少凋亡、发生G1期阻滞、抑制其迁移与侵袭、有效调控增殖、周期、黏附相关基因与蛋白的表达，从而抑制胃癌的演进与发展。但其抑制肿瘤细胞凋亡不利于抗肿瘤药物的治疗，将为抑癌基因ING5与胃癌化疗之间建立联系，为我们更全面了解胃癌发病的分子机制与靶基因治疗提供新的思路与方向。

参考文献：

［1］胡在敏，王川，季文，等.重组质粒pEGFP⁃N1⁃NPRL2对人胃癌细胞生物学特性的影响［J］.细胞与分子免疫学杂志，2012，28（10）：1020-1024.

［2］张旭涛，孟瑾，张峰.生长抑制因子5抑制肺癌细胞增殖作用的研究［J］.中国医药导报，2015，12（4）：4-7.

［3］SHISEKI M，NAGASHIMA M，PEDEUX RM，et al.p29ING4 and p28ING5 bind to p53 and p300，and enhance p53 activity［J］.Can⁃cer Res，2003，63（10）：2373-2378.

［4］CENGIZ B，GUNDUZ E，GUNDUZ M，et al.Tumor⁃specific muta⁃tion and downregulation of ING5 detected in oral squamous cell car⁃cinoma［J］.Int J Cancer，2010，127（9）：2088-2094.

［5］LI X，KIKUCHI K，TAKANO Y.INGgenes work as tumor suppres⁃sor genes in the carcinogenesis of head and neck squamous cell car⁃cinoma［J］.J Oncol，2011，2011：1-11.

［6］XING YN，YANG X，XU XY，et al.The altered expression of ING5 protein is involved in gastric carcinogenesis and subsequent progres⁃sion［J］.Hum Pathol，2011，42（1）：25-35.

［7］LIU N，WANG J，WANG J，et al.ING5 is a Tip60 cofactor that acet⁃ylates p53 in response to DNA damage［J］.Cancer Res，2013，73 （12）：3749-3760.

［8］ZHANG F，BAUMER N，RODE M，et al.The inhibitor of growth pro⁃tein 5（ING5）depends on INCA1 as a co⁃factor for its antiprolifera⁃tive effects［J］.PLoS One，2011，6（7）：e21505.

［9］赵春阳，徐广全.ING5在食管鳞癌中的表达及意义［J］.高师理科学刊，2013，33（3）：71-72.

［10］路美玲，陈斐，王勤婉，等.ING5在肝癌中表达的研究［J］.胃肠病学，2010，15（2）：86-89.

图4　ING5过表达对SGC-7901细胞增殖、凋亡、黏附相关基因mRNA以及蛋白表达的影响Fig.4　The effect of ING5 mRNA and protein expression of SGC-7901 cells

图5　ING5过表达对SGC-7901细胞肿瘤异种移植模型增殖、凋亡的影响 ×200Fig.5　The effect of ING5 expression on SGC-7901 cells in xenograft and tumor proliferation and apoptosis×200

（编辑武玉欣）

网络出版时间：

中图分类号R735.2

文献标志码A

文章编号0258-4646（2016）07-0577-06

DOI：10.12007/j.issn.0258⁃4646.2016.07.001

基金项目：国家自然科学基金（81172371；81472544）；辽宁省教育厅科学研究基金（LJQ2014093）；锦州医科大学附属第一医院校长基金（XZJJ20140201；XZJJ20140203）

作者简介：杨雪峰（1988-），男，技师，硕士.

通信作者：郑华川，E-mail：zhenghuachuan@hotmail.com

收稿日期：2015-05-16

Anti⁃tumor Effects of ING5Gene on Gastric Cancer

YANG Xuefeng，GOU Wenfeng，ZHAO Shuang，SHEN Daofu，WU Yazhou，LI Junjun，ZHENG Huachuan
（Cancer Research Central Laboratory，Tumor Basicand Translational Laboratory，Laboratorial Animal Center，The First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical Universi⁃ty，Jinzhou121001，China）

AbstractObjective To study the effect ofING5 gene on growth inhibition of gastric cancer. Methods ING5 expressing plasmid was transfect⁃ed into SGC⁃7901 cells. The cell viability was assessed by CCK⁃8，cell apoptosis and cycle was detected by flow cytometry analysis，the migration and invasion was evaluated by scratch and transwell，the expressions of mRNA and protein were determined by real⁃time quantitative PCR and West⁃ern blot respectively. Nude mice were implanted subcutaneously with SGC⁃7901 cells and tumor size and related protein were analyzed. Results After transfection of pEGFP⁃N1⁃ING5，the proliferation of gastric cancer SGC⁃7901 cells was significantly inhibited（P ＜ 0.05），the apoptosis was decreased（P ＜ 0.05），the percentage of G1 phase was increased and G2 phase was decreased（P ＜ 0.05），the ability of migration and invasion was reduced（P ＜ 0.05），the expression ofNF⁃κB，PI3K，p⁃Akt1/2/3，Bcl⁃2，XIAP，β⁃catenin，c⁃myc mRNA，and protein levels were significantly in⁃creased（P ＜ 0.05），and the expression ofAkt1/2/3、MMP9 mRNA and protein levels were significantly decreased（P ＜ 0.05）. Conclusion The ING5 gene inhibits the SGC⁃7901 cell proliferation，induces G1 arrest，inhibits the migration and invasion，and effectively regulates the related genes and proteins about cell proliferation，cell cycle and adhesion，but reduces apoptosis.ING5 can inhibit the evolution and development of gastric can⁃cer.

Keywordsgastric cancer；ING5；tumorgenesis；gene therapy