某区人乳头瘤状病毒基因型的分布研究

李春燕（云南省楚雄彝族自治州人民医院医学检验科，云南 楚雄 675000）



某区人乳头瘤状病毒基因型的分布研究

李春燕
（云南省楚雄彝族自治州人民医院医学检验科，云南 楚雄 675000）

【摘要】目的 了解楚雄地区女性人群人乳头状瘤病毒（HPV）基因型在宫颈疾病中的感染状况及其分布特点。方法 采用PCR-反向点杂交法对2013年12月至2014年3月在楚雄州人民医院妇科就诊的1936例女性患者进行23种HPV（低危型6、11、42、43、81，高危型HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、53、66、73、82、83）基因型的分型检测，分析常见感染亚型和分布特点。结果 研究人群HPV感染总阳性率为18.8%，常见的5种高危型为52、58、16、53、51；常见的2种低危型为81、42。单重感染的比例为87.3%，多重感染的比例为12.7%。结论 楚雄地区HPV感染亚型有独特的区域分布特点，HPV 52和58型有相当高的流行率，值得重视。

【关键词】人乳头状瘤病毒；宫颈癌；基因分型 ；PCR；杂交

宫颈癌是妇科肿瘤中仅次于乳腺癌的第二大恶性肿瘤［1］，人乳头状瘤病毒已明确为宫颈癌的病因［2-3］，HPV感染检测也因此成为宫颈癌筛查的必不可少的内容。HPV是一种小分子双链DNA病毒，按其基因型序列的多态性可分为100多型，根据不同基因型与癌分生危险性高低又可分为：低危型HPV，如6、11等，常引起外生殖器湿疣、宫颈上皮内低度病变（CIN1）等良性病变；高危型HPV，如16、18等，与宫颈癌及宫颈上皮内高度病变（CIN2/3）的发生相关［4］。但中国各地区宫颈癌中HPV感染及型别分布情况可能存在较大差异。为了解楚雄地区HPV感染的基因型分布，对1936例妇科患者进行了HPV感染分型检测，报道如下。

l 材料与方法

1.1 研究对象：2013年12月至2014年3月到楚雄州人民医院妇科就诊的女性患者1936例，受检者年龄16～74岁，平均年龄37.7岁。

1.2 试剂与仪器：采用PCR体外扩增和DNA反向点杂交相结合的DNA芯片技术。利用HPV的基因特点设计特异引物，可以扩增出23种HPV基因型的目标片段，再将扩增产物与固定在膜条上的包括18种高危型和5种低危型在内的分型探针进行杂交，依据杂交信号的有无来判断是否有这些HPV基因型的存在。试剂：人乳头瘤病毒基因分型检测试剂盒（深圳亚能生物技术有限公司），可检测23种HPV基因型别，包括18种高危型：16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、53、66、73、82、83型；5种低危型：6、11、42、43、81型。仪器：HEMA9600扩增仪及YN-H16恒温杂交仪。

1.3 方法

1.3.1 标本取样与要求：利用专用采样器对就诊女性患者进行宫颈脱落细胞的取样，放入细胞保存液中送检，4 ℃保存，2 d内检测。

1.3.2 HPV-DNA提取：利用试剂盒提取DNA，具体操作步骤详见说明书。

1.3.3 PCR扩增：采用HEMA9600扩增仪按照以下条件进行扩增：50 ℃15 min，95 ℃ 10 min，94 ℃ 10 s、42 ℃ 90 s、72 ℃ 30 s扩增10个循环，94 ℃ 10 s、46 ℃ 60 s、72 ℃ 20 s扩增30个循环，72 ℃延伸5 min。

1.3.4 杂交显色：打开YN-H16恒温杂交仪，预热至51 ℃。取出标记有23种HPV基因型寡核苷酸探针基因芯片的膜条，在膜条编号区标上与PCR反应液相对应的编号及阳性对照和阴性对照。按顺序分别放入杂交管中，然后加入6 mL A液。把对应编号的PCR扩增产物依次全部加入到杂交管中，拧紧管盖，放入沸水浴中煮沸10 min，且确保A液液面完全位于沸水液面之下。沸水浴完成后，取出杂交管，放入杂交仪中杂交不少于1.5 h，完成后进行膜条酶标显色。具体操作步骤详见试剂盒说明书。

1.3.5 结果判定：肉眼观察检测结果，阳性点呈现蓝色圆点，实验的每张膜条在IC位点必须出现蓝色杂交信号；阴性对照除IC位出现杂交信号外其余位点均不出现杂交信号；阳性对照必须在相应的HPV基因型位点出现杂交信号。根据膜条上显色位点判读相应的HPV基因型，记录结果后把膜条装至密封袋中扫描，最后放入4 ℃保存。

2 结 果

2.1 共检测到23种基因型，其中阳性例数363例，阳性率为18.8% （363/1936）。高危型中的73、82型仅各占1例。见表1。

2.2 各亚型感染率见表1，分布从高到低依次为52型、58型、81型、16型、53型、42型、51型、43型、39型、18型、56、66型、68、6型、33、59型、35、11型、45型、31型、83型、73、82型。

表1 HPV各基因型阳性率

2.3 单重感染人数317例（87.3%），多重感染人数46例（12.6%）。低危感染人数67例（18.5%），高危感染人数250例（68.9%），混合感染人数46例（12.7%）。

3 讨 论

宫颈癌是严重威胁妇女生命健康的恶性肿瘤，近年来呈年轻化趋势［5］。大量的流行病学资料和相关研究证实，HPV是引起宫颈癌及癌前病变的主要原因，其感染检测已成为宫颈癌防治中必不可少的筛查内容。国外宫颈癌HPV感染以HPV16和18亚型为主 ，而我国在HPV型别及感染率上与国外存在较大差异，且国内不同地域之间亦有差异。吴玉萍等［6］报道，江西省宫颈癌患者主要感染 HPV亚型依次为16、58、33、31型；赵健等［7］对北京地区3086例患者筛查 HPV阳性率为63.1%，最常见亚型为 HPV16、58、52、33、53、6和CP8304型；蒋卫平等［8］调查浙江丽水地区365例妇科患者HPV阳性率为49.6%，前5位HPV基因型依次为16、52、58、33、53型，未发现43及35型。根据上述结果可见，国内报道HPV16型感染率最高，其次为58型，其他型别的HPV感染率存在较大地区差异，其中HPV18和45型在国内报道中感染率均较低，而其分别在欧美和非洲西部较常见。本研究发现，楚雄地区检出 HPV最常见型别依次为高危型 52（16.8%）、58（12.9%）、16（10.7%）、53（9.9%）、51（8.0%）。低危型81 （11.0%）、42（8.8%），其余亚型感染率均低于8%。表明楚雄地区HPV型别及感染率与国内其他地区存在较大差异，HPV52和58型有相当高的流行率，国内常见的HPV16型位居第三，HPV18型则较少见，仅5.5%。低危型以HPV81和42型较常见，6型、11型感染率相对较低。也进一步证明即使同种族人群 ，HPV感染的基因型也存在明显的人群和地域特点。

由于目前检测样品数量的限制，在HPV型别的分布上存在着一定的偏差。但是随着工作的进一步进行，将会得到较完善的统计数据，对楚雄地区一般人群及高危人群的HPV型别有比较明确的了解。本研究为HPV感染的进一步预防和治疗作出了有益的参考，为HPV疫苗的研制和应用提供有力的分子流行病学数据。

参考文献

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［2］ Graflund M，Sorbe B，Sigurdard6ttir S，et a1.Relation between HPV-DNA and expression of p53，bcl-2，p21WAF-1，MIB-1，HER-2/ neu and DNA ploidy in early cervical carcinoma：correlation with clinical outcome［J］.Oncol Rep，2004，12（1）：169-176.

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［6］ 吴玉萍，陈裕隆，李隆玉，等.宫颈癌患者人乳头瘤病毒（HPV）主要型别及其感染研究［J］.病毒学报，2005，4（21）：269-273.

［7］ 赵健 ，杨英捷，廖秦平.导流杂交基因芯片技术在人乳头状瘤 病毒感染分型检测中的临床应用 ［J］.中华检验医学杂志，2006，29（12）：1148-1151.

［8］ 蒋卫平，丁茂文，张晓梅，等.浙江省丽水地区妇科患者21种人乳头状瘤病毒感染状况分析［J］.浙江医学杂志，2009，31（9）：1323-1324.

中图分类号：R737.33

文献标识码：B

文章编号：1671-8194（2016）16-0008-02

A Region Human Papilloma Virus Genotype Distribution Research

LI Chun-yan
（Department of Medical Laboratory， Chuxiong Yi Nationality Autonomous Prefecture People's Hospital， Chuxiong 675000， China）

［Abstract］Objective Understanding of chuxiong region women Human papilloma virus（HPV）genotypes infection status in cervical disease and its distribution characteristics. Methods By the method of PCR to reverse hybridization， in December 2013， the current conditions are， in March 2014， the people's hospital of department of gynaecology clinic of 1936 female patients with 23 kinds of HPV （low-risk type 6， 11， 42， 43， 81， high-risk HPV16， 18， 31，33， 35， 39， 45， 51， 52， 56， 58， 59， 68， 53， 66， 73， 82， 83） genotype classification test， analysis of common subtype infection and distribution characteristics. Results The study population HPV total positive rate was 18.8%， the common type 5 kinds of high-risk for 52， 58， 16， 53， 51； Common two low-risk type of 81， 42. The single infection ratio of 87.3%， Multiple infections proportion was 12.7%. Conclusion HPV infection subtype chuxiong region are the unique characteristics of regional distribution， HPV type 52 and 58 have quite high prevalence rate， worthy of attention.

［Key words］Human papilloma virus（HPV）； Cervical cancer； Genotyping； PCR； The hybrid translation