昆虫内生真菌Chaetomium globosum ZWC5的分离鉴定及其抗癌活性代谢产物的研究

杨会祥，邓园园，李　薇，吕静南，徐　婵，马云瑞，杨新洲，林亲雄

(中南民族大学药学院，中国 武汉　430074)



昆虫内生真菌Chaetomium globosum ZWC5的分离鉴定及其抗癌活性代谢产物的研究

杨会祥，邓园园，李薇，吕静南，徐婵，马云瑞，杨新洲，林亲雄

(中南民族大学药学院，中国 武汉430074)

摘要为了研究中华稻蝗内生真菌ZWC5菌株及其活性代谢产物, 通过菌株形态和其rDNA的ITS序列分析，鉴定其为球毛壳霉(Chaetomium globosum)；采用MTT法和流式细胞技术测定其代谢产物的抗癌活性，结果表明其石油醚提取物对肝癌细胞HepG2和SMMC-7721的IC50分别为22.1 mg/L,33.8 mg/L，可诱导HepG2细胞凋亡，而对正常肝细胞LO-2未显示明显的细胞毒性；GC-MS检测分析显示其醚提物主要含12种化学成分.

关键词中华稻蝗; 内生真菌; 球毛壳霉; 抗癌活性; 气相色谱-质谱

内生菌是一类长期与寄主共同生存的特殊环境微生物，它们与寄主保持多样的共生关系，在寄主的生存周期中起着一定的生理作用[1].内生菌广泛分布于昆虫体内，几乎所有的昆虫都有内生菌[2].昆虫种类丰富、结构复杂、生活环境特殊，所以源于昆虫体内的内生菌也同样具有生物多样性、复杂性和特殊性，其内生菌可能会产生结构新颖、类型丰富的活性次级代谢产物，而且其内生菌产生的活性化合物的结构类型已远超出昆虫本身代谢产物的范围.因此，昆虫内生菌是重要的活性次生代谢产物的源泉.国内外的研究者已从昆虫内生菌中分离出生物碱类、萜类、甾体、醌类、肽类、内酯、酚类等化合物，这些化合物具有抗菌、细胞毒性、抗疟活性、促进神经胶质细胞生长、抗动脉粥样硬化、免疫抑制、致突变等多种生理或药理活性[3]，其中一些化合物结构新颖并具抗癌活性，如从昆虫内生菌虫草棒束孢(Isariafarinosa)分离的farinosone B及paecilosetin对小鼠白血病细胞P388的IC50分别为1.1 mg/L和3.2 mg/L[4]，从昆虫内生菌Cordycepssinensis中分离的甾体化合物1对肿瘤细胞有较强的抑制活性[5].从同翅目介壳虫总科的昆虫内生菌Paecilomycescinnamomeus中分离得到一个新的环肽paecilodepsipeptide A对KB和BC细胞的IC50分别为5.9 mg/L和5.6 mg/L[6].郭志勇等从菜粉蝶分离到交链孢霉属真菌，从其乙酸乙酯萃取物中分离的4-甲氧基格链孢酚，二氢腾毒素，腾毒素，环羟基脯亮二肽，5′-methoxy-6-methyl-biphenyl-3,4,3′-triol和altenusin共6种化合物从对EGFR和VEGFR-1及c-Met三种受体酪氨酸激酶具有不同程度的抑制活性[7].但与昆虫种类研究相比,目前对昆虫共生菌及其代谢产物研究偏少，进行昆虫内生菌活性代谢产物，特别是抗癌活性化合物的筛选是一个前景广阔的研究领域.

本研究小组在研究共生菌的活性次生代谢产物的过程中，从中华稻蝗虫体内分离到一株内生真菌，经鉴定为球毛壳霉(Chaetomiumglobosum). MTT方法检测发现其发酵液石油醚提取物对HepG2和SMMC-7721两个肝癌细胞株具有显著的细胞毒性，且可以引起HepG2细胞的凋亡，而对正常肝细胞LO-2未显示出明显的毒性，具有深入研究的意义，本文总结与报道现阶段取得的研究成果.

1材料和方法

1.1仪器与材料

活性测试用显微镜：B202型(Olympus)；酶标仪：Spectra Max 340PC型(Molecular Devices)；旋转蒸发器：RV10型(IKA公司)；流式细胞仪：FACSCALIBUR型(BD公司)；GC-MS仪：DSQ Ⅱ(Thermo公司)；毛细管柱：Zebron ZB-35HT (Phenomenex公司)；PCR仪：C1000 touch(Bio-Rad公司)；凝胶成像系统：ChemiDoc XRS型(Bio-Rad公司)；细胞株：肝癌细胞株HepG2和Hep3B及人胚肾成纤维细胞株HEK-293(American Type Culture Collection，Rockville, MD, USA)；RPMI1640培养基(Gibco Inc，美国)；胎牛血清(四季青公司，杭州)；吖啶橙、溴化乙啶(Sigma，美国).

1.2昆虫材料收集与共生真菌的分离纯化

蝗虫于2013年8月捕捉于武汉市马鞍山森林公园，经湖北省林业科学研究院陈京元研究员鉴定为中华稻蝗(Oxyachinensis).将昆虫在75%酒精中浸泡5 min，再用0.5%的次氯酸浸泡2 min，表面灭菌后用无菌水冲洗虫体3次，用无菌滤纸吸干水分，在无菌条件下用解剖刀将虫体切成0.5 cm长的小块移接到PDA培养基(含氨苄青霉素和链霉素各100 mg/L)上，28 ℃培养7～14 d，将虫体组织块中长出的菌丝用PDA培养基连续重复纯化3次.同时将未进行表面消毒不做剪切的虫体置于PDA平板上作为对照，以此作为分离得到的真菌是否为昆虫内生真菌的主要参考依据，分离菌株采用甘油低温冻存，菌种保存于中南民族大学药学院微生物菌种库.

1.3真菌ZWC5的鉴定

菌落形态观察：将ZWC5菌株接种在PDA平板上培养14 d，连续观察菌丝粗细、颜色、菌落形态、培养基背面色素等形态学特征.

核糖体ITS序列的测定：取ZWC5适量菌丝接于PDA液体培养基中，25 ℃震荡(150 r/min)培养5 d，过滤得菌丝体，用无菌水冲洗3次，冷冻干燥后备用.ZWC5菌株总DNA的提取方法参照文献[8]进行，提取总DNA经琼脂糖电泳检测合格后进行目的片段的PCR扩增与测序.ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTA TTGATATGC-3′由武汉擎科生物有限公司合成.PCR反应体系总体积50 μL，包括：2.5 mmol/L的dNTP 2 μL，5 U/μL的Taq酶0.4 μL，25 mmol/L的MgCl23μL，5 μL的10×PCR Buffer(试剂由大连宝生物工程有限公司提供)，25 μmol/L的ITS1和ITS4各1 μL，10 ng的DNA模板，补足去离子水使总体积达到50 μL，进行PCR扩增.PCR扩增产物由上海桑尼生物科技有限公司进行纯化和测序.

1.4ZWC5发酵液石油醚提取物的制备

将ZWC5菌株活化后，用PDA液体培养基，28 ℃下180 r/min避光振荡培养4 d，减压浓缩3倍，按1∶1的体积比加入丙酮，超声1 h，破壁，真空减压浓缩除去丙酮，菌体和菌液的混合溶液按体积比1∶1采用石油醚萃取3次，40 ℃真空减压浓缩干燥，即为石油醚提取物(ZWC5-Pe).

1.5ZWC5-Pe的抗肝癌活性测定[9]

将ZWC5-Pe固体5 mg溶于25 μL的DMSO中，配成200 g/L的母液.取对数生长期的HepG2，SMMC-7721和LO-2细胞，调节细胞浓度为5×104个/mL，每孔0.2 mL接种至96孔培养板，培养24 h后每孔分别添加待测样品和1640细胞培养液各0.2 mL，母液用无小牛血清的1640培养液配制成终浓度为10，20，40，100，200 mg/L的样品液，每个浓度设3复孔，同时设不加样品的阴性对照、不加样品和细胞的空白对照，继续培养48 h后，分别加入5 g/L的MTT 20 μL继续培养4 h后，吸去培养液，每孔加入0.15 mL DMS，振摇30 min，于550 nm下测定每孔A值，计算各样品对肝癌细胞的生长抑制率和半数抑制浓度(IC50).

1.6ZWC5-Pe诱导肝癌细胞的凋亡

肝癌细胞凋亡形态的观察：调节对数生长期的HepG2和SMMC-7721细胞浓度为5×104个/mL，接种于6孔培养板中，24 h细胞贴壁后，加入不同浓度的样品液，培养48 h，用倒置相差显微镜观察细胞形态并拍照[10].

采用流式细胞仪Annexin V-FITC/PI 双染法检测细胞凋亡[11]：将处于对数生长期的HepG2细胞吹打分散于含10%胎牛血清的培养基中，制备单细胞悬液，每孔4×105接种于6孔板中.37 ℃下5%CO2培养箱中培养24 h，加入一定浓度的样品液干预细胞24 h；同时设置阴性对照组，作用终止时收集细胞于离心管，用遇冷PBS洗涤细胞2次，1 000 r/min离心5 min，弃上清，将细胞悬液悬浮于500 μL 1×Buffer中，每管加Annexin V-FITC 5 μL和 PI 5 μL，震荡混匀，室温下避光染色10 min，用流式细胞仪检测细胞凋亡及凋亡率.

1.7ZWC5-Pe化学成分的GC-MS分析

气相色谱条件：采用ZB-35HT毛细管柱(0.25 mm×30 m)和ECD检测器，以高纯氦气为载气，设定起始柱温度50 ℃，以3 ℃/min的速度升温至210 ℃，温度稳定后以1 mL/min的流速常规进样.质谱条件：以离子源温度230 ℃，电子能量70 eV，四极杆温度150 ℃，转接口温度280 ℃，电子倍增器电压350 V，质量扫描范围35～400 amu进行电子轰击离子源质谱法测定各成分的分子离子峰.在NIST98.L标准谱库内检索GC-MS获得的质谱数据，结合相关文献资料确定化学成分，采用峰面积归一法定量各成分的相对含量.

2结果和分析

2.1ZWC5菌种鉴定

菌落形态(图1，彩图见封三)：在PDA培养基上菌丝最初为白色，后期淡褐色，具灰白色气生菌丝，气生菌丝稀少，背面棕褐色，常具橄褐色渗出物，菌落边缘常呈不整齐的波裂状，与文献[8]的描述基本一致.

ZWC5菌株ITS序列的GeneBank 登录号为KT832070.在GenBank数据库中进行BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi) 分析，在GenBank数据库中获得ITS rDNA 序列与ZWC5菌株相近的菌株，计算ZWC5菌株与相近菌株的ITS序列的核苷酸差异值，以此进行最大同源性排序，采用Neighbor-joining法构建相近菌株的系统发生树.经ITS rDNA序列比对分析，ZWC5的ITS rDNA 序列与ChaetomiumglobosumHM365254，KM030576，HQ914911菌株的序列同源性均为100%(图2).根据菌落形态与5.8S ITS rDNA序列分析的结果，将ZWC5菌株鉴定为球毛壳霉(Chaetomiumglobosum).

图1　ZWC5菌株在PDA平板上的菌落形态Fig.1　Colony morphology of fungus ZWC5 on the PDA culture medium

图2　ZWC5菌株基于rDNA ITS序列的系统进化树Fig.2　Phylogenetic tree of fungus ZWC5 based on rDNA ITS sequence

图3　ZWC5-Pe对细胞的体外增殖抑制活性Fig.3　Cell proliferation inhibitory activity of ZWC5-Pe in vitro

2.2ZWC5-Pe的体外抗肝癌活性

采用MTT法，评价了ZWC5-Pe对HepG2和SMMC-7721的体外抗肿瘤活性，结果显示ZWC5-Pe在5～200 mg/L的范围内，对两种肿瘤细胞均显示抗肿瘤活性，且有明显的量效关系，对HepG2和SMMC-7721细胞的IC50分别为22.1 mg/L和33.8 mg/L，而200 mg/L的ZWC5-Pe对LO-2细胞几乎不显示毒性(图3).

2.3ZWC5-Pe对肝癌细胞形态的影响

人肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721经ZWC5-Pe提取物处理后，用倒置显微镜观察细胞生长情况，结果(图4，彩图见封三)表明，随样品浓度增加，人肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721逐渐变圆，脱落，悬浮细胞逐渐增多，且悬浮细胞出现皱缩，周围出现凋亡小体状，呈现明显的凋亡特征，而阴性对照组细胞生长良好，细胞贴壁较牢，细胞间紧密相联.

图4　ZWC5-Pe对HepG2及SMMC-7721细胞形态的影响Fig.4　Effects of ZWC5-Pe on cell morphology of HepG2 and SMMC-7721

2.4ZWC5-Pe诱导肝癌细胞凋亡

ZWC5-Pe诱导HepG2肝癌细胞凋亡检测结果(图5)显示，随着ZWC5-Pe给药浓度增加，HepG2细胞凋亡比例随给药浓度梯度递增. 50，100，150 mg/L ZWC5-Pe作用HepG2细胞24 h后，早期凋亡比例分别为30.0%,31.9%,2.0%.晚期凋亡细胞，也即坏死细胞，能够被FITC染色，也能被PI染色，细胞分布在散点图上象限.该结果表明ZWC5-Pe能够显著地引起HepG2细胞的凋亡.

2.5ZWC5-Pe化学成分的GC-MS分析

ZWC5-Pe采用1.7的实验流程，利用GC-MS方法检测ZWC5-Pe的化学成分，其GC-MS总离子流图谱(图6)如下.分析结果表明，真菌ZWC5的石油醚提取物(ZWC5-Pe)含有多种成分，主要化学成分有12种.根据各分子离子碎片峰的相似度在NIST98.L 标准谱库中检索，可初步鉴定ZWC5-Pe提物中含有的12种主要化学成分(表1)，大多为烷烃、脂肪酸，其中含量超过10%的成分初步鉴定为2,5-二叔丁基酚,硬脂酸,异黄酮苷,酞酸二丁酯，还有许多含量较低的分子离子峰未能在库中检出.

图6　ZWC5-Pe提取物的GC-MS谱图Fig.6　GC-MS spectrum of ZWC5-Pe extracts

序号保留时间/min峰面积/%化合物名称分子式19.3021.82,6,10-trimethyl-dodecaneC15H32211.0511.53-methyl-tetradecaneC15H32312.0222.1Diethyl-2-(2-yanoethyl)-malonnateC10H15NO4412.93013.62,5-bis(1,1-dimethylethyl)-phenolC14H22O514.4280.82-methyl-pentadecaneC16H34614.5330.6HexadecaneC16H34717.8180.5TetradecanoicacidC14H28O2818.5650.3Tri(2-chloroethyl)-phosphataeC6H12Cl3O4P920.5036.81,2-BenzenedicarboxylicacidC16H22O41022.16024.8OctadecanoicacidC18H36O21123.13911.2DaidzinC21H20O31226.29716.7DibutylphthalateC16H22O4

3讨论

球毛壳霉菌(Chaetomiumglobosum)是一种常见的腐霉菌，广泛分布于自然界的各种基物和发霉的含纤维素的日常用品上，包括植物残体、土壤、草食和杂食动物及鸟类和鼠类的粪便、种子、材、皮革等[12].有研究报道从侧柏叶、银杏叶中分离到球毛壳菌[13-14]，本研究从中华稻蝗体内分离出该菌尚属首次报道，球毛壳菌能否与蝗虫形成共生关系尚未明确，也可能为球毛壳菌的孢子存在于蝗虫的消化道内，进而被分离出来.

球毛壳菌的代谢产物主要包括麦角邕醇、大黄酚、棒曲霉素、球毛壳菌素类物质等[15]，其中球毛壳菌素A对腐霉菌、灰霉病菌、立枯丝核菌、镰刀菌等植物病原真菌具有良好的广谱杀菌活性，同时临床证明其具有抗肿瘤活性[13].本研究发现其发酵液的醚提物对肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721有显著抗肝癌活性，且对正常细胞没有明显的细胞毒性，因此，该菌的代谢产物具有很好的研究价值与潜力.由于GC-MS未检测到球毛壳菌素A，课题组将对其抗癌活性成分进行深入的研究.

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(编辑WJ)

DOI:10.7612/j.issn.1000-2537.2016.04.003

收稿日期：2015-08-01

基金项目：中南民族大学十二五“民族药学”国家级实验教学示范中心项目;国家级大学生创新训练项目(GXX14211)

*通讯作者,E-mail：linqinxiong@mail.scuec.edu.cn

中图分类号Q819

文献标识码A

文章编号1000-2537(2016)04-0017-06

Study on Isolation and Taxonomy Determination of Insect Derived Endophytic FungusChaetomiumGlobosumZWC5 and Its Anticancer Active Metabolites

YANGHui-xiang,DENGYuan-yuan,LIWei,LYUJing-nan,XUChan,MAYun-rui,YANGXin-zhou,LINQin-xiong*

(College of Pharmaceutical Sciences, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074, China)

AbstractIn order to study the endophytic fungus ZWC5 from Oxya chinensis and its active metabolites，the fungus ZWC5 is determined as Chaetomium globosum based on fungus’s morphology and its rDNA ITS sequence analyses. The anticancer activity of its metabolites was tested by the MTT method and flow cytometry. Our results indicate that the petroleum ether extract of Chaetomium globosum ZWC5 can induce apoptosis of HepG2 cell with IC50values of 22.1 mg/L and 33.8 mg/L against hepatocellular carcinoma HepG2 and SMMC-7721 cells, respectively. It did not show any obvious toxicity against normal liver LO-2 cell. Chemical analysis of its petroleum ether extract by GC-MS displays that the extract contained 12 main chemical constituents.

Key wordsOxya chinensis; endophytic fungi; Chaetomium globosum; anticancer activty; gas chromatography-mass spectrometry