姜黄素对糖尿病大鼠心肌纤维化的影响及机制研究

李香波　薛长春　吴震宇　李洁超　张赟峰　赵维纳

(北京市大兴区人民医院内分泌科，北京　102600)



实 验 研 究

姜黄素对糖尿病大鼠心肌纤维化的影响及机制研究

李香波薛长春吴震宇李洁超张赟峰赵维纳1

(北京市大兴区人民医院内分泌科，北京102600)

【摘要】目的研究姜黄素对糖尿病大鼠心肌纤维化的影响及机制。方法将35只雄性SD大鼠以1%链脲佐菌素(STZ)溶液45 mg/kg一次性尾静脉注射制备糖尿病模型后，随机分为模型组、姜黄素低剂量组及姜黄素高剂量组，每组各10只，另取10只大鼠为正常对照组。姜黄素低剂量组及姜黄素高剂量组大鼠分别予姜黄素溶液15、30 mg/(kg·d)腹腔注射，正常对照组及模型组大鼠予等容积6%乙醇和6%聚乙二醇混合液腹腔注射，连续用药8周。最后一次给药后采集各组大鼠心肌组织标本，以实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测miR-130b 表达，Western-blot 法检测TGF-β1、Ⅰ型胶原蛋白表达。结果与正常对照组相比，模型组大鼠心肌miR-130b表达明显降低(P<0.05)，TGF-β1蛋白及Ⅰ型胶原蛋白表达水平明显升高(P<0.05)；与模型组相比，姜黄素低、高剂量组大鼠心肌miR-130b表达明显升高(P<0.05)，TGF-β1蛋白及Ⅰ型胶原蛋白表达水平降低(P<0.05)，且姜黄素高剂量组与姜黄素低剂量组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论姜黄素可通过miR-130b介导，抑制TGF-β1表达，对糖尿病大鼠心肌有保护作用。

【关键词】糖尿病，实验性；心肌纤维化；姜黄素；蛋白

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是严重的心肌病变，心肌间质胶原纤维沉积和纤维化是引起DCM的重要因素[1]。转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)是心肌组织中重要的信号分子，参与心肌纤维化、心肌细胞肥大和凋亡等生物学过程[2]。姜黄素是从中药姜黄中提取的酚性有效单体[3]，干预糖尿病心肌纤维化[4]，但机制尚不明确。本实验通过研究姜黄素对糖尿病大鼠心肌TGF-β1的影响和机制，为姜黄素治疗糖尿病心肌纤维化提供实验依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物雄性SD大鼠(北京华阜康生物科技股份有限公司)，动物合格证号2014038，体质量180～230 g，分笼饲养，自由饮食和摄水，实验室内自然昼夜光线照明，通风良好，室内温度保持在18～25 ℃，相对湿度为40%～70%。

1.1.2药品及试剂姜黄素，Sigma-Aldrich 公司；BulgeTMmiRNA qRT-PCR Primer Set，实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)试剂盒，广州市锐博生物科技有限公司；兔抗鼠TGF-β1多克隆抗体和兔抗鼠CollagenⅠ多克隆抗体，Abcam公司；兔抗鼠β-actin多克隆抗体，武汉博士德生物工程有限公司；OMEGA RNA 组织提取试剂盒，北京宜科思源科技有限公司，引物由广州市锐博生物科技有限公司合成。

1.1.3主要仪器便携式血糖仪，美国强生公司；Stepone荧光定量PCR，美国ABI公司；蛋白质双向电泳系统、Mini Trans-Blot蛋白转膜仪，美国BIO-RAD公司。

1.2方法

1.2.1模型制备雄性SD大鼠45只，适应性喂养1周后随机取10只为正常对照组；其余35只以1%链脲佐菌素(STZ)溶液45 mg/kg一次性尾静脉注射。正常对照组予等容积0.1 mmol/L枸橼酸缓冲液一次性尾静脉注射。注射后72 h非同日连续3次测定空腹血糖均≥16.7 mmol/L为糖尿病模型成功。将糖尿病模型大鼠随机分为模型组、姜黄素低剂量组及姜黄素高剂量组，每组各10只。

1.2.2给药方法姜黄素低剂量组及姜黄素高剂量组大鼠分别予姜黄素溶液(姜黄素溶于6%和乙醇和6%聚乙二醇混合液，药液比例为1∶1)15 mg/(kg·d)、30 mg/(kg·d)腹腔注射。正常对照组及模型组予等容积6%乙醇和6%聚乙二醇混合液(1∶1)腹腔注射，连续用药8周。每周测各组大鼠体质量，根据体质量调整用药量。

1.3观察指标及方法

1.3.1标本采集最后一次给药后，股动脉放血法处死各组大鼠，开胸取出心脏，用0.9%氯化钠注射液冲洗干净，取5 mm×5 mm×5 mm左心室心肌组织，浸入4%多聚甲醛溶液中固定，用石蜡进行包埋。

1.3.2Real-time PCR 检测miR-130b 表达用OMEGA RNA 组织提取试剂盒提取心肌组织总RNA，紫外检测仪分别在 260、280 nm 波长下检测 RNA 浓度及纯度。按照BulgeTMmiRNA qRT-PCR Primer Set步骤进行逆转录，引物序列为：miR-130b上游引物(5'→3')CTGGGCAGTGCAATGATGAAA，miR-130b下游引物(5'→3')GGTGTCGTGGAGTCGGCAA，qPCR反应体系：SYBR Green 9 μL，cDNA 2 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL。反应条件：95.0 °C，20 s，循环1次；95 °C，10 s，循环40次。miR-130b和U6的相对表达量用公式2-△△CT计算[5]。

1.3.3Western-blot 法检测TGF-β1、Ⅰ型胶原蛋白表达提取心肌总蛋白，检测蛋白浓度和纯度，Western-blot法观察TGF-β1、Ⅰ型胶原蛋白表达水平。采用4000 R柯达成像系统采集图像，进行图像分析(条带的光密度值与条带面积比值为单位面积蛋白浓度)，以β-actin为内参。

2结果

2.14组大鼠用药8周后空腹血糖及体质量比较见表1。

表1　4组大鼠用药8周后空腹血糖及

与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05；与姜黄素低剂量组比较，#P<0.05

由表1可见，与正常对照组相比，模型组大鼠空腹血糖升高，体质量减轻 (P<0.05)。与模型组比较，姜黄素低、高剂量组大鼠空腹血糖无明显变化(P>0.05)，但体质量明显下降(P<0.05)，且姜黄素高剂量组大鼠体质量低于姜黄素低剂量组，比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.24组大鼠心肌miR-130b表达水平比较见表2，图1。

组 别n倍数正常对照组101.00±0.01模型组100.41±0.01*姜黄素低剂量组100.69±0.03△姜黄素高剂量组100.81±0.02△#

与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05；与姜黄素低剂量组比较，#P<0.05

图1　4组大鼠心肌miR-130b表达

注：NC为正常对照组，MG为模型组，Cur-L为姜黄素低剂量组，Cur-H为姜黄素高剂量组

由表2、图1可见，与正常对照组比较，模型组大鼠心肌miR-130b表达降低(P<0.05)；与模型组比较，姜黄素低、高剂量组大鼠心肌miR-130b表达量明显升高(P<0.05)，且姜黄素高剂量组高于姜黄素低剂量组，比较差异有统计学意义(P<0.05)。2.34组大鼠心肌TGF-β1蛋白表达水平比较见表3，图2。

表3　4组大鼠心肌TGF-β1蛋白表达水平比较　±s

与正常对照组比较， *P<0.05；与模型组比较，△P<0.05；与姜黄素低剂量组比较，#P<0.05

图2　4组大鼠心肌TGF-β1蛋白表达

注：NC为正常对照组，MG为模型组，Cur-L为姜黄素低剂量组，Cur-H为姜黄素高剂量组

由表3、图2可见，与正常对照组相比，模型组大鼠心肌TGF-β1蛋白表达水平明显升高(P<0.05)；与模型组比较，姜黄素低剂量组及高剂量组大鼠心肌TGF-β1蛋白表达水平降低(P<0.05)，且姜黄素高剂量组低于姜黄素低剂量组，比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.44组大鼠心肌Ⅰ型胶原蛋白表达水平比较见表4，图3。

表4　4组大鼠心肌Ⅰ型胶原蛋白表达水平比较　±s

与正常对照组比较， *P<0.05；与模型组比较，△P<0.05；与姜黄素低剂量组比较，#P<0.05

图3　4组大鼠心肌Ⅰ型胶原蛋白表达

注：NC为正常对照组，MG为模型组，Cur-L为姜黄素低剂量组，Cur-H为姜黄素高剂量组

由表4、图3可见，与正常对照组相比，模型组大鼠心肌Ⅰ型胶原蛋白表达水平明显升高(P<0.05)；与模型组比较，姜黄素低剂量组及高剂量组大鼠心肌Ⅰ型胶原蛋白表达水平降低(P<0.05)，且姜黄素高剂量组低于姜黄素低剂量组，比较差异有统计学意义(P<0.05)。

3讨论

心肌纤维化是糖尿病心肌病特征性病理表现，高糖刺激导致心肌成纤维细胞代谢紊乱，Ⅰ型胶原合成增加[6]。研究表明，小剂量链脲佐菌素诱导大鼠2型糖尿病模型成模8周后检测该模型有心脏肥大，心脏超微结构发生损伤性改变，心肌间质纤维化明显，Ⅰ型胶原蛋白含量增加[7]。本研究Western-blot结果显示，雄性SD大鼠注射1% STZ溶液8周后，模型组Ⅰ型胶原蛋白表达明显升高，与文献报道一致，可成功诱导糖尿病大鼠心肌纤维化模型。分布在心脏细胞外基质(extracellular matrix，ECM)中的胶原蛋白有Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型等，在正常情况下，心肌 ECM 中的胶原蛋白在体内各种机制的调节下处于一种不断合成和降解的平衡状态，维持心脏结构和功能的完整性和协调性[8]，任何一种蛋白改变都可能影响心肌间质的功能。Ⅰ型胶原蛋白是构成粗纤维的主要成分，约占胶原蛋白总量的80%以上，弹性小、僵硬度大、抗牵拉性强是Ⅰ型胶原蛋白的主要特性，主要作用是维持心室壁的强度和硬度。Ⅰ型胶原蛋白表达增加，进而在心肌细胞间隙沉积，导致心室壁僵硬，顺应性下降，影响心室的舒张和收缩功能[9]。

TGF-β1/Smads信号转导通路参与糖尿病心肌纤维化[10-11]，高糖刺激导致心肌中TGF-β1的表达明显增加。本研究Western-blot结果表明，模型组大鼠TGF-β1表达明显高于正常对照组，但是目前关于TGF-β1参与心肌纤维化机制的研究很少。Castro NE[12]在研究糖尿病肾病机制时发现，肾小球系膜细胞中TGF-β1异常表达导致细胞外基质异常积聚，纤维组织增生明显，MicroRNAs调节TGF-β1表达，参与导致糖尿病肾脏纤维化相关基因的表达，转染miR-130b mimic，明显抑制TGF-β1的表达，推测miR-130b 是 TGF-β1 依赖的基因。本研究表明，在糖尿病大鼠心肌中miR-130b表达明显下调，说明miR-130b可能参与糖尿病心肌纤维化的发病机制。

姜黄素是从姜科姜黄属植物姜黄根茎中提取的多酚类天然产物，药理作用广泛，主要为抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗纤维化[13]，目前在糖尿病心肌纤维化中姜黄素的作用研究很少。本研究通过复制糖尿病模型，姜黄素溶液腹腔注射，血糖检测结果表明，与模型组比较，姜黄素干预组空腹血糖变化无统计学意义(P>0.05)，推测姜黄素没有降糖作用；Western-blot结果表明姜黄素干预后，Ⅰ型胶原蛋白及TGF-β1蛋白的表达量明显降低，大鼠心肌纤维化明显改善，且有剂量依赖性；Real-time PCR结果表明姜黄素能够上调miR-130b表达。推测姜黄素对糖尿病大鼠心肌的保护作用与上调miR-130b表达，抑制TGF-β1信号通路有关，这为糖尿病心肌纤维化的治疗提供了实验依据。

参考文献

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(本文编辑：曹志娟)

doi:10.3969/j.issn.1002-2619.2016.06.023

作者简介：李香波(1978—)，女，主治医师，学士。研究方向：糖尿病及并发症的诊治。

【中图分类号】R587.23；R285.5；R542.23

【文献标识码】A

【文章编号】1002-2619(2016)06-0887-04

(收稿日期：2015-02-10)

Effects of curumin on myocardial fibrosis in diabetic rats and its mechanism

LIXiangbo,XUEChangchun,WUZhenyu,etal.

DepartmentofEndocrinology,DaXingDistrictPeople'sHospitalinBeijingGity，Beijing102600

【Abstract】Objective To investigate the effects of curumin on myocardial fibrosis in diabetic rats and its mechanism. Methods 35 male SD rats which were induced as diabetic model by 1% streptozotocin (45 mg/kg), were randomly divided into model, curumin low dose and high dose group, 10 rats in each group. Another 10 normal rats were employed as the control group. The curumin low dose and high dose group received intraperitoneal injection of curumin 15 and 30 mg/(kg·d), respectively. The control and model group received intraperitoneal injection of the mixture of 6% ethyl alcohol and 6% polyethylene glycol, continuously for 8 weeks. The expression of myocardial miR-130b were detected by real-time PCR, and the TGF-β1 and type Ⅰ collagen were detected by western-blot. Results The expression of myocardial miR-130b in model group was obviously decreased as compared with that in control group (P<0.05), and the TGF-β1 and type Ⅰ collagen were increased (P<0.05). The expression of myocardial miR-130b in low and high dose groups were obviously increased as compared with that in model group (P<0.05), and the TGF-β1 and type Ⅰ collagen were decreased (P<0.05), and there were statistical differences between low and high dose group (P<0.05). Conclusion Curcumin has protective effects on myocardium in diabetic rats through inhibiting TGF-β1 expression mediated by miR-130b.

【Key words】Diabetes; Experimental; Myocardial fibrosis; Curcumin; Protein

1牡丹江医学院红旗医院神经科，黑龙江牡丹江157011