GeXP联合多重PCR系统在腹泻病毒检测中的应用

石莹　陈肖潇　樊学军　田绿波　杨雨　张薇薇



·技术方法·

GeXP联合多重PCR系统在腹泻病毒检测中的应用

石莹陈肖潇樊学军田绿波杨雨张薇薇

610041 成都，四川出入境检验检疫局国际旅行卫生保健中心(石莹、陈肖潇、樊学军、田绿波、杨雨)；610500 成都医学院公共卫生系(张薇薇)

【摘要】目的利用GeXP系统结合多重PCR技术，建立诺如病毒(GI和GII组)、轮状病毒、星状病毒的方法。方法根据4种病毒的序列特征，制备病毒标准品质粒，收集病原体样本，利用GenBank下载4种病毒的核苷酸序列，根据4种病毒的序列特征，利用GeXP express Profiler设计特异性引物，优化条件使GeXP系统能够特异性、快速的检测对应病毒。评价其灵敏度、特异性及功效，并应用于120份临床标本检测。结果优化后的引物能特异性的检测各病毒，无交叉反应；灵敏度为100%，特异性为99.53%，功效为99.62%，与荧光定量PCR检测结果一致性为99.51%，检测浓度最低至5×103/μl拷贝，在已知临床样本灵敏度高、特异性好。结论GeXP方法的建立为快速、准确的检测这4种腹泻病毒提供了便利，对口岸突发群体性腹泻的病原体检出有重要意义。

【主题词】腹泻病毒；GeXP；多重PCR

Fund programs: General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine Public Benefit Research Foundation of China (201210046)；General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine Research Foundation of China (2014IK064)；Sichuan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau Research Foundation (SK201402)

病毒性腹泻因其传播速度快，临床上难区分，给诊断及治疗带来了极大的困难。引起病毒性腹泻的主要病原体有轮状病毒、诺如病毒、肠道腺病毒和星状病毒等[1]。诺如病毒是成人病毒性腹泻最主要的原因，其次依次为轮状病毒、星状病毒和腺病毒[2-3]。诺如病毒根据其基因特征，主要分为6个基因型，GI、GII 和GIV基因型主要感染人类，而GIII 和GV可感染猪、牛和鼠[4]。我国主要流行的诺如病毒基因型为GI、GII。根据中国疾病预防控制中心2009-2013年对全国27个省份173家哨点医院开展诺如病毒监测，其中89.8%为GⅡ组病毒，10.2%为GI 组[5]。对这些病毒的鉴定，传统的病毒分离培养及血清学检测方法过程较繁杂，且耗时耗力，因此不利于口岸突发群体性腹泻的快速制定疫情应对措施[6-7]。

近年来，基于Multiplex-PCR及毛细管电泳开发出多重基因表达系统(GeXP)技术，使用通用引物实现多重PCR，最后用毛细管电泳分析PCR产物大小，使病原体检测省去琼脂糖凝胶电泳，并能同时检测多达35种病原体，满足实验室及临床快速、准确检测的需求[8-10]。芦春斌等[11]利用GeXP系统检测人乳头状瘤病毒并分型；Fang等[12]利用GeXP系统同时检测到乙型流感、甲型H1N1、H3N2和H5N1流感病毒，且灵敏度高，表明GeXP系统在病毒检测方面具有巨大潜力。

目前，GeXP系统在腹泻病毒检测方面还未见报道。由于肠道腺病毒是DNA病毒，因混有DNA会干扰RNA检测，DNA会被消化，无法检测。因此本研究将探究建立一种GeXP系统用于检测诺如I型病毒、诺如II型病毒、轮状病毒、星状病毒的方法。

1材料与方法

1.1材料诺如I型病毒、诺如II型病毒、轮状病毒、星状病毒标准品质粒由Invitrogen公司完成，并通过酶切线性化。病原体临床样本由四川省疾病预防控制中心提供(诺如I型病毒14份、诺如II型病毒37份、轮状病毒35份和星状病毒16份)。MiniBEST病毒RNA/DNA提取试剂盒、PrimeScript RT-PCR Kit反转录试剂盒均购自大连宝生物科技有限公司。诺如病毒GI组用于引物设计，涉及到4种基因型，7个毒株，分别是：GenBank: KP407450.1、KF039737.1、KF039735.1、KF039734.1、KF039733.1、KF039732.1以及 KF039730.1。诺如病毒GII组用于引物设计，涉及到6种基因型，10个毒株，分别是：GenBank: KJ407074.2、KJ407072.2、KJ407073.1、JQ911595.1、JQ911596.1、JQ911597.1、 JQ911598.1、 KC409301.1、KC409302.1以及KC409301.1。

1.2引物的设计与合成利用GenBank下载各病毒的核苷酸序列，使用ClustalX软件进行多序列同源性比对分析，将结果输入GeXP eXpress Profiler工具设计多重PCR特异性引物，并使用NCBI Primer-Blast和Primer Premier 5.0软件进行分析筛选。分别在各特异性引物上、下游5′端加上一段非同源通用引物序列Un-F(上游带有荧光标记)和Un-R，构成特异嵌合引物。各引物均由上海Invitrogen公司合成(表1)。

本研究设计的诺如病毒特异性引物的引物区域是在诺如病毒的Pol(RNA依赖的RNA聚合酶)基因区域。

表1　引物信息

1.3总RNA提取及cDNA合成提取120个临床样本血清中的病毒RNA，NanoDrop测定RNA浓度。反转录使用PrimeScript RT-PCR Kit进行cDNA的第一条链的合成。反应体系：各特异性嵌合引物下游1 μl(10 pmol/L)，dNTPs 1 μl(10 mmol/L)，RNA模板2 μl，5×PrimeScript 缓冲液4 μl，RNA酶抑制剂0.5 μl(40 U/ μl)，PrimeScript RTase 1 μl(200 U/μl)，RNase Free dH2O 10.5 μl。反应条件：50 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min，冰上放置或-20 ℃保存。

1.4引物特异性验证利用GeXP系统进行引物单一特异性验证。PCR体系：5×PCR Buffer(含通用引物上下游各0.25 μmol/L)4 μl，MgCl2(25 μmol/L)4 μl，特异嵌合引物(各引物浓度均为0.2 μmol/L/L)2 μl，Taq DNA Polymerase 0.7 μl，单一病毒质粒(5×102拷贝)2 μl，加ddH2O至20 μl。PCR反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循环30次；72 ℃最终延伸10 min。PCR产物经过GeXP毛细管电泳系统检测分析。

利用GeXP系统进行引物多重特异性验证，PCR体系：5×PCR Buffer(含通用引物上下游各0.25 μmol/L)4 μl，MgCl2(25 μmol/L)4 μl，特异嵌合引物(各引物浓度均为0.2 μmol/L/L)2 μl，Taq DNA Polymerase 0.7 μl，各病毒混合质粒(4×102ng / μl)2 μl，加ddH2O至20 μl。PCR反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循环30次；72 ℃最终延伸10 min。PCR产物经过GeXP毛细管电泳系统检测分析。

1.5灵敏度检测将标准品5×106拷贝/ μl，做10倍浓度稀释，每个梯度浓度的样品重复3份，用于PCR反应及GeXP检测，将具有90%～95%阳性检出率的最低病毒水平作为最低检测限。

1.6稳定性检测利用人DNA与RNA作为干扰物。人DNA干扰组：GD1组，在20 μl逆转录体系中，加入5×103拷贝病毒和5 ng人全基因组DNA；GD2组，在20 μl逆转录体系中，加入5×103拷贝病毒和50 ng人全基因组DNA；GD3组，在20 μl逆转录体系中，加入5×103拷贝病毒和500 ng人全基因组DNA，每组做18个重复。人RNA干扰组：GR1组，在20 μl逆转录体系中，加入5×103拷贝病毒和500 ng人RNA；GR2组，在20 μl逆转录体系中，加入5×103拷贝病毒和50 ng人RNA；GR3组，在20 μl逆转录体系中，加入5×103拷贝病毒和5 ng人RNA，每组做18个重复。PCR体系：5×PCR Buffer(含通用引物上下游各0.25 μmol/L)4 μl，MgCl2(25 μmol/L)4 μl，特异嵌合引物(各引物浓度均为0.2 μmol/L/L)2 μl，Taq DNA Polymerase 0.7 μl，各组逆转录产物2 μl，加ddH2O至20 μl。PCR反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循环30次；72 ℃最终延伸10 min。PCR产物经过GeXP毛细管电泳系统检测分析。

1.7临床样本检测收集120份腹泻患者粪便标本，连续检测20 d，计算检测方法的灵敏度、特异性及功效。

2结果

2.1引物特异性验证诺如I型、诺如II型、轮状病毒、星状病毒病原体质粒的GeXP结果。四组实验所检测出的峰值条带大小均与本实验所设计的各病毒质粒的PCR产物大小相符(图1A-D)。混合质粒的PCR产物为4条目的条带，设计的特异嵌合引物在混合实验中可以排除干扰，特异性扩增(图1E)，四个峰值位于为163.67 bp、210.33 bp、279.51 bp、326.70 bp，符合本实验所设计的诺如I型、轮状病毒、诺如II型、星状病毒病原体质粒PCR产物条带大小。

2.2灵敏度检测将标准品稀释后经PCR及GeXP检测，最低检出限为5×103拷贝(表2)。

2.3稳定性检测GD1和GR1组均能全部检出目标病毒，不影响对病毒的检测结果；GD2、3组和GR2、3组部分检出目标病毒，存在假阴性结果(表3)。

2.4临床样本检测结果对120个病原体临床样本进行检测，以实时荧光PCR检测4种病原体为标准，腹泻病毒检测方法的灵敏度为100%，特异性为99.53%，功效为99.62%，与荧光定量PCR检测结果一致性为99.51%。结果显示本研究的方法可以用于临床检测这4种病原体(表4)。

3讨论

腹泻一直是危害人类健康的常见病和多发病，传播速度快，临床上难以区分，传统的病毒分离培养及血清学检测方法过程较繁杂，且耗时耗力，因此不利于快速制定疫情应对措施。

国境口岸腹泻病毒的病原体筛查传统多运用多重PCR法。但在运用过程中，我们发现多重PCR法存在一些不可避免的问题，如特异性和灵敏度不高；同时在反应体系中存在几对引物，常常出现扩增中某些特定片段优势扩增，其他片段不能扩增出，很难达到5重以上检测，远远达不到高通量快速检测和分析的目标。本研究初步建立了一种GeXP遗传分析系统与多重PCR技术联用的方法，采用了通用引物与特异性引物相结合的策略，有效解决多重PCR过程中的扩增偏爱性，结合毛细管电泳提高了检测的功效。

A为诺如I型，峰值163.56 bp; B为诺如II型，峰值279.58 bp; C为轮状病毒，峰值211.31 bp; D为星状病毒，峰值327.58 bp; E 多重引物特异性验证图1　单一和多重引物特异性验证结果A:Norovirus GI,peak 163.56 bp；B:Norovirus GII,peak 279.58 bp；C:Rotavirus, peak 211.31 bp；D:Astrovirus, peak 327.58 bp；E: Sepecificity analysis of Multi-primers Fig.1　Specificity of single and multiple primers amplification

表2　各浓度检测限

表3　稳定性检测

表4　GeXP与实时荧光PCR检测结果的比较

表5　GeXP的诊断效能评价

GeXP法对病毒检测的灵敏度和特异性很大程度上取决于引物和探针的设计，既要求引物和探针选取的序列为目标生物的高度保守性片段，又要求此序列与其他生物保持较好的特异性。本研究各病原体的引物设计所用的核苷酸序列来自GenBank，用Clustalx软件进行多序列同源性比对分析后，将结果输入GeXP express Profiler 工具设计多重特异性引物，最后用NCBI Primer-Blast和Primer Premier 5.0软件分析筛选设计好的引物，最后得到4对特异性引物。实验结果表示，单一性检测和多重检测中，4对引物扩增后的产物均表现出了高特异性，说明本实验设计是合理有效的；在临床样本的检测中，与实时荧光PCR法比较，也均能得到高特异性结果。但本研究因为无法得到其他腹泻病毒的阳性临床样本，只进行了最常见的4种病原体的方法研究，今后还需进一步加大腹泻病毒种类，完善GeXP在腹泻病毒检测中的应用。

GeXP遗传分析系统与多重PCR技术联用的方法对4种腹泻病毒进行检测，比一代测序更加省时、比二代测序更加经济，实现了快、准、经济的三大突破，与实时荧光PCR法比较，可以取得相同的灵敏度、特异性，但更满足口岸应急检测高通量的需求，为口岸爆发性疫情的快速控制提供了可能性。

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通信作者：张薇薇，Emai:363002530@qq.com

DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.03.016

基金项目：s国家质检公益性科研专项(201210046)；国家质检总局科研项目(2014IK064)；四川出入境检验检疫局科研项目(SK201402)

(收稿日期：2016-02-23)

GeXP system combined with multiplex PCR technology for detection of diarrhea viruses

ShiYing,ChenXiaoxiao,FanXunjun,TianLyubo,YangYu,ZhangWeiwei

SichuanEntry-exitInspectionandQuarantineBureauInternationalTravelHealthcareCenter,Chengdu610041,China(ShiY,ChenXX,FanXJ,TianLB,YangY);DepartmentofPublicHealth,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China(ZhangWW)Correspondingauthor:ZhangWeiwei,Email:363002530@qq.com

【Abstract】ObjectiveGenomeLab Genetic Analysis System (GeXP) and multiplex-PCR were combined to detect Noroviruse I、II, Astrovirus and Rotavirus. MethodsThe sequences of these viruses were obtained from Genbank of NCBI, and specific primer pairs were designed by GeXP eXpress Profiler. After optimization, the GeXP system could amplify specific fragments of each virus. The sensitivity and specificity of multiple PCR assay was also evaluated.Optimized assay was further validated with 120 clinical specimens collected from the CDC.ResultsThese primer pairs were successfully used for detecting these viruses at the level of 5×103copies/ μl without cross reaction. The sensitivity, specificity and efficiency of GeXP assay was 100%, 99.53% and 99.62%, respectively. Comparing to Real-time PCR, the consistence rate reached 99.51% in 120 clinical samples.ConclusionsThe combined detection of GeXP and multiplex PCR assay could be a high-throughput, rapid and highly specific and sensitive method used in the screening of the diarrhea viruses.

【Key words】Diarrhea viruses; GeXP; Multiplex-PCR