川芎嗪对骨关节炎兔软骨细胞增殖与凋亡的影响及其机制研究

胡旭光，甘仲霖，张　毅

(1. 西南医科大学附属中医医院，四川 泸州 646000；2. 西南医科大学公共卫生学院,四川 泸州 646000；3. 四川省成都市第三人民医院蒲江医院蒲江县人民医院，四川 蒲江 611630)



川芎嗪对骨关节炎兔软骨细胞增殖与凋亡的影响及其机制研究

胡旭光1，甘仲霖2，张毅3

(1. 西南医科大学附属中医医院，四川 泸州 646000；2. 西南医科大学公共卫生学院,四川 泸州 646000；3. 四川省成都市第三人民医院蒲江医院蒲江县人民医院，四川 蒲江 611630)

[摘要]目的探讨川芎嗪对骨关节炎兔软骨细胞增殖与凋亡的影响及其作用机制。方法选取12只兔建立骨关节炎动物模型，体外分离培养软骨细胞，并分为模型组、川芎嗪低剂量组、川芎嗪中剂量组、川芎嗪高剂量组，另选取3只正常兔体外分离培养软骨细胞作为正常对照组。模型组和正常对照组给予10% DMEM培养液进行培养，而川芎嗪低、中、高剂量组分别给予含10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL川芎嗪注射液的培养液进行培养。采用流式细胞仪测定兔软骨细胞周期及增殖指数，采用TUNEL法检测细胞凋亡情况，采用MTT法检测软骨细胞活性，采用Western-blot法检测软骨细胞中bax、bcl-2、Caspase-3蛋白表达情况。结果模型组G0/G1期细胞所占比例及PI均明显低于正常对照组(P均<0.05)，S期及G2/M期细胞所占比例均明显高于正常对照组(P均<0.05)；川芎嗪中、高剂量组G0/G1期细胞所占比例、PI均显著高于模型组和川芎嗪低剂量组(P均<0.05)，而S期及G2/M期细胞所占比例均显著低于模型组和川芎嗪低剂量组(P均<0.05)。川芎嗪中、高剂量组软骨细胞凋亡率均明显低于模型组(P均<0.05)，川芎嗪高剂量组显著低于低剂量组(P<0.05)，而川芎嗪高剂量组与正常对照组比较差异无统计学意义；川芎嗪中、高剂量组软骨细胞活性均显著高于模型组(P均<0.05)，川芎嗪高剂量组显著高于低剂量组(P<0.05)，而川芎嗪高剂量组仍然低于正常对照组(P<0.05)。模型组软骨细胞中bax及Caspase-3表达量均明显高于正常对照组(P均<0.05)，bcl-2表达量显著低于正常对照组(P<0.05)；而川芎嗪各剂量组软骨细胞中bax及Caspase-3表达量均明显低于模型组(P均<0.05)，bcl-2表达量均明显高于模型组(P均<0.05)，且川芎嗪高剂量组各指标改善情况均显著优于低剂量组(P均<0.05)。结论川芎嗪能够促进软骨细胞的增殖，同时还能通过上调抗凋亡因子bcl-2表达，下调软骨细胞促凋亡因子bax以及Caspase-3表达而抑制软骨细胞的凋亡。

[关键词]川芎嗪；兔；骨关节炎；软骨细胞；增殖；凋亡

骨关节炎是常见的退行性变关节疾病，好发于负重关节，是中老年人常见的疾病，其发病率随着年龄的增长而增高，严重威胁中老年人身心健康。在骨关节炎发病过程中，关节软骨的降解是其主要变化，其中软骨细胞是关节软骨中唯一的细胞，其在软骨的形成、修复以及代谢中起着关键作用[1]。有研究发现,当发生骨关节炎时，软骨细胞的凋亡率增加，而软骨细胞的凋亡也是造成骨关节炎病变的关键因素[2]。如何有效抑制软骨细胞的凋亡及软骨基质降解成为骨关节炎当前研究的热点。近期有研究表明，川芎嗪不仅能够促进软骨细胞进入增殖周期，促进软骨细胞的增殖，同时可抑制软骨细胞凋亡蛋白bcl-2的表达，减少软骨细胞的凋亡[3]。本研究观察了川芎嗪对兔骨关节炎软骨细胞增殖及凋亡的影响，旨在为川芎嗪的临床应用提供理论依据。

1实验资料

1.1实验动物普通成年新西兰兔15只，雄性7只，雌性8只，月龄6个月，体质量2.0～2.5(2.3±0.1)kg，西南医科大学实验动物中心提供,实验动物许可证号：SYXK(川)2013-181。

1.2实验药物、试剂与仪器川芎嗪注射液由北京市燕京药业有限公司提供，国药准字H20043160，规格：40 mg/2 mL。TUNEL成套试剂盒由武汉博士德生物工程公司提供。胎牛血清及DMEM培养液、胰蛋白酶等均购于Hy-clone公司。流式细胞分析仪器及配套设备由美国BD公司提供。

1.3实验方法

1.3.1骨关节炎模型的建立随机选取其中12只兔，采用切断前后交叉韧带、内侧副韧带以及切除内侧半月板改良Hulth法于兔双后膝关节建立兔骨关节炎动物模型；余3只进行假手术作为正常对照组，操作方式与上述方法相同，只是不切断内侧副韧带、前后交叉韧带和内侧半月板。所有动物术后均给予青霉素20万IU肌注，1次/d，连续7 d，以防止发生感染；另外，对手术动物实施一笼一兔喂养，手术7 d后每天驱赶兔子来回走动，每次约30 min。

1.3.2兔软骨细胞的分离、分组与培养手术完成后第9周，采用耳缘静脉空气栓塞法处死所有兔，无菌条件下选取双侧股骨远端以及双侧胫骨近端处关节软骨，放置在D-Hank’s液中清洗，然后将软骨片剪成大小为1 mm2碎片分装在试管中，加入0.2%胶原酶10 mL，37 ℃恒温水浴以及磁力搅拌下消化，45 min后取上清，离心收集细胞，然后再采用胶原酶重复消化，最后将2次收集的细胞加入含20%胎牛血清的DMEM完全培养基中制备成软骨细胞悬液。将骨关节炎软骨细胞随机分为模型组、川芎嗪低剂量组、川芎嗪中剂量组、川芎嗪高剂量组，按照1×104mL-1密度接种于96孔培养板上，每组设定6个复孔。正常对照组、模型组给予10%DMEM培养液进行培养，川芎嗪低剂量组、中剂量、高剂量组分别另加入10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL川芎嗪注射液进行培养。

1.4检测指标

1.4.1细胞周期及增殖指数采用流式细胞仪测定，细胞培养24 h后，在胰蛋白酶消化下收集各孔细胞，1 000 r/min离心5 min,弃上清，PBS溶液洗2次，采用70%乙醇进行固定，在4 ℃环境下放置过夜。离心分离乙醇，经PBS洗涤后将细胞重新放置在1 mL PBS中，加入10 μg/mL RNase 37 ℃孵育30 min，然后加入碘化丙啶50 μg/mL上机测定。采用Cell Quest软件获取软骨细胞104个，然后再采用modFit软件分析DNA数据，并测定细胞DNA含量，得到细胞周期3个时相(G0/G1、S、G2/M期)的软骨细胞数，计算增殖指数(PI)。PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)。

1.4.2软骨细胞凋亡情况将余下软骨置入4%甲醛溶液中固定，石蜡包埋，常规脱蜡水化后，采用TUNEL法根据细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作。先分别用双蒸水和PBS缓冲液冲洗3次，5 min/次，37 ℃下加入20 μg/mL蛋白酶K消化15 min，用PBS缓冲液连续冲洗3次，5 min/次，然后放入3%的H2O2甲醇中25 min，再次用PBS缓冲液连续冲洗3次，时间同上；将样本置于37 ℃ TUNEL反应混合液中90 min，PBS缓冲液冲洗3次；置于浓度为5%的羊血清中室温封闭20 min；37 ℃下POD孵育30 min；PBS缓冲液冲洗3次；DAB显色，苏木精复染，并于流水中蓝化。切片中软骨细胞核内呈现棕黄色颗粒为阳性。每张切片光镜下计数10个400倍视野，以平均计数100个细胞中含凋亡细胞个数作为凋亡率，即凋亡率(%)=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

1.4.3软骨细胞活性采用MTT法检测。干预72 h后，在上述软骨细胞培养孔中分别加入10 μL MTT，在37 ℃、5% CO2培养箱饱和湿度下孵育4 h弃上清。加入Formazan溶解液100 μL，并在室温下振荡10 min，最后在酶标仪上检测570 nm处光密度值(OD值)，结果取6个复孔的均值。

1.4.4bax、bcl-2及Caspase-3蛋白表达情况细胞培养72 h后，采用Western-blot法检测各组软骨细胞中 bax、bcl-2蛋白表达情况：采用PBS缓冲液将经过预冷的软骨细胞漂洗2次，时间5 min，吸净PBS后加入RIPA裂解液(含PMSF)，将样品转移至离心管中，分4次超声粉碎，每次15 s，弃沉淀后将上清液加至BCA工作液中，振荡器处理30 s，放置于37 ℃条件下30 min，利用酶标仪于570 nm波长处测定bax、bcl-2蛋白相对表达量。采用比色法检测各组软骨细胞中Caspase-3蛋白表达情况：参照上述方法处理软骨细胞待检样品，得上清液后取50 μL置于96孔板中，加入50 μL Reaetion Buffer(×2)，再加入5 μL 浓度为4 mmol/L的Substrate，37 ℃水浴箱中孵育120 min，注意避光，采用酶标仪于450 nm波长处测定Caspase-3蛋白相对表达量。

2结果

2.1各组软骨细胞周期及PI情况模型组G0/G1期细胞所占比例及PI均明显低于正常对照组(P均<0.05)，S期及G2/M期细胞所占比例均明显高于正常对照组(P均<0.05)；川芎嗪中、高剂量组G0/G1期细胞所占比例、PI均显著高于模型组和川芎嗪低剂量组(P均<0.05)，而S期及G2/M期细胞所占比例均显著低于模型组和川芎嗪低剂量组(P均<0.05)。见表1。

表1　各组软骨细胞周期及PI情况

注：①与正常对照组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05；③与川芎嗪低剂量组比较，P<0.05。

2.2各组软骨细胞凋亡情况正常对照组、模型组及川芎嗪低、中、高剂量组软骨细胞凋亡率分别为(7.42±2.68)%，(30.64±4.55)%，(27.65±4.28)%，(19.75±3.67)%，(8.12±0.63)%，川芎嗪中、高剂量组软骨细胞凋亡率均明显低于模型组(P均<0.05)，川芎嗪高剂量组低于低剂量组(P<0.05)，而川芎嗪高剂量组与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3各组软骨细胞活性正常对照组、模型组及川芎嗪低、中、高剂量组软骨细胞活性分别为0.59±0.04，0.36±0.05，0.38±0.06，0.43±0.04，0.47±0.06。川芎嗪中、高剂量组软骨细胞活性均高于模型组(P均<0.05)，川芎嗪高剂量组高于低剂量组(P<0.05)，而川芎嗪高剂量组仍然低于正常对照组(P<0.05)。

2.4各组软骨细胞中bax、bcl-2及Caspase-3蛋白表达情况模型组软骨细胞中bax及Caspase-3表达量均高于正常对照组(P<0.05)，bcl-2表达量低于正常对照组(P<0.05)；而川芎嗪各剂量组软骨细胞中bax及Caspase-3 表达量均明显低于模型组(P均<0.05)，bcl-2表达量均明显高于模型组(P均<0.05)，且川芎嗪高剂量组各指标改善情况均优于低剂量组(P均<0.05)。见表2。

表2　各组软骨细胞中bax、bcl-2及Caspase-3蛋白表达情况

注：①与正常对照组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05；③与川芎嗪低剂量组比较，P<0.05。

3讨论

目前关于骨关节炎发病机制的研究中，软骨的受损是公认的病理学特征。虽然软骨细胞仅占软骨组织总体积的1%～5%，细胞外基质占90%以上，但软骨细胞属于多功能细胞，其不仅能够有效合成和分泌基质，同时对控制细胞外基质的分布也具有重要作用[4]。在骨关节炎中，软骨细胞数量随着骨关节炎炎症程度的加重呈现下降的趋势，而基质异常钙化以及细胞数量的变化与软骨纤维化的增加频率呈一致性，说明细胞结构减少在骨关节炎发生中起着关键作用[5-6]。

细胞凋亡属于正常的生理过程，是由基因调控损伤细胞或非需要细胞的程序性死亡过程，但是若细胞出现过度凋亡则为病理所致。如果软骨细胞出现凋亡现象，则会导致软骨细胞数量减少，从而使软骨基质的合成以及分泌减少，严重时会引起维持软骨基质合成以及降解酶系统出现紊乱现象，最终造成关节软骨退变[7-8]。bax和bcl-2、Caspase-3均为粒细胞凋亡调控因子，其中bcl-2基因家族属于细胞凋亡的主要调控基因，其不仅在细胞凋亡中处于调控机制的终末端，而且在维持细胞数量以及细胞生理性分化发育的动态平衡中起着关键作用。研究发现，bcl-2的过量表达会形成bcl-2同源二聚体，可有效抑制细胞的凋亡，因此上调bcl-2是对软骨细胞的保护，以防止其凋亡[9-10]。而bax和bcl-2属于一对正负调节因子，当两者比值呈现升高的趋势，则将会促使Caspase介导的线粒体凋亡途径激活，最终导致细胞的凋亡，而bax的过度表达，不仅可以与bcl-2形成异源二聚体，拮抗bcl-2抑制凋亡的作用，同时也会形成bax同源二聚体，促进细胞色素C的释放，最终导致Caspase的细胞凋亡。Caspase-3属于CPP32亚家族中重要成员，其通常以无活性的酶原形式存在于细胞质中，其在凋亡信号的刺激下，很容易经过蛋白水解酶的作用激活为活化形式，不仅能够降解多种蛋白底物，而且Caspase-3异常高表达对加快软骨细胞凋亡、诱导并加重组织损伤起着重要作用[11]。

川芎是血中之气药，具有祛风止痛、活血行气、开郁燥湿等功效。其中川芎嗪是川芎中单体提取物，其化学名为四甲基吡嗪，属酰胺类生物碱。其不仅能够减少骨关节炎软骨组织中IL-1β的含量，同时还能对软骨基质中MMP-13产生抑制作用，促进TIMP-1的合成，最终延缓软骨细胞退变形成[12]。李应池等[13]研究发现，川芎嗪能够通过对软骨细胞G1期调节蛋白表达的作用，促进软骨细胞bcl-2蛋白的表达，最终达到调节软骨细胞周期的作用。

本研究结果表明，川芎嗪能够有效促进细胞增殖，且随着川芎嗪浓度的增加，软骨细胞PI指数也逐渐升高。川芎嗪中、高剂量组软骨细胞凋亡率均明显低于模型组，川芎嗪高剂量组低于低剂量组，而川芎嗪高剂量组与正常对照组比较差异无统计学意义；川芎嗪中、高剂量组软骨细胞活性均高于模型组，川芎嗪高剂量组高于低剂量组，而川芎嗪高剂量组仍然低于正常对照组。模型组软骨细胞中bax及Caspase-3表达量均高于正常对照组，bcl-2表达量低于正常对照组；而川芎嗪各剂量组软骨细胞中bax及Caspase-3 表达量均明显低于模型组，bcl-2表达量均明显高于模型组，且川芎嗪高剂量组各指标改善情况均优于低剂量组。提示川芎嗪可促进骨关节炎软骨细胞的增殖，同时还能通过上调抗凋亡因子bcl-2表达，下调软骨细胞促凋亡因子bax以及Caspase-3表达抑制软骨细胞的凋亡。但是由于兔软骨细胞与人软骨细胞的生物学特性存在一定的差异，因此还有待进一步选取人软骨细胞(如外伤后截肢的软骨细胞进行培养)进行深入研究。

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[作者简介]胡旭光，男，主治医师，主要从事骨伤科疾病的临床诊断与治疗。 [通信作者]甘仲霖，E-mail:511254989@qq.com

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.22.008

[中图分类号]R-33

[文献标识码]A

[文章编号]1008-8849(2016)22-2418-04

[收稿日期]2015-10-10

Effects and mechanism of Ligustrazine on the proliferation and apoptosis of chondrocytes in rabbits

HU Xuguang1, GAN Zhonglin2, ZHANG Yi3

(1. Chinese Medical Hospital of Xinan Medical College, Luzhou 646000, Sichuan, China; 2. Public Medical College of Xinan Medical University, Luzhou 646000, Sichuan, China; 3. The Third Hospital of Chengdu， Pujiang Hospital， The People’s Hospital of Pujiang County, Pujiang 611630, Sichuan, China)

Abstract:Objective It is to discuss the effects of Ligustrazine on proliferation and apoptosis of chondrocytes in rabbits with osteoarthritis, and to study the mechanism of action of ligustrazine. Methods 12 rabbits were selected to establish the animal model of osteoarthritis, and the chondrocytes were cultured in vitro,which were randomly divided into model group, low, medium and high dose of ligustrazine groups.Another 3 normal rabbits were select to get their chondrocytes as normal control group which were cultured in vitro. Model group and control group were cultured by 10% DMEM culture liquid, and low, medium and high dose of ligustrazine groups were cultured by the culture liquid containing 10 μg/mL, 20 μg/mL and 30 μg/mL ligustrazine injection.The proliferation index and cell stage were detected by flow cytometry, apoptosis was detected by TUNEL method, activity of chondrocytes were detected by MTT method, the expression of bax, bcl-2 and Caspase-3 in the cells was detected by Western blot method. Results The G0/G1 stage and PI levels in the ligustrazine groups of every dose and the model group were lower than those in the normal control group (P<0.05), while the G2/M stage and the S stage levels were higher than those in the normal control group (P<0.05), and the G0/G1 stage and PI levels in the high dose ligustrazine group were significantly higher than those in the low and middle ligustrazine groups (P<0.05), while the levels of G2/M stage and the S stage were significantly lower than those in the low and middle ligustrazine groups (P<0.05).The apoptosis rate of chondrocytes in ligustrazine group was significantly lower than that in model group (P<0.05), but significantly lower than that in control group (P<0.05).The expressions of Bax and Caspase-3 in the model group were significantly higher than those in control group,which of bcl-2 was significantly lower than that in the control group(P<0.05).The expressions of Bax and Caspase-3 in the low dose, medium dose and high dose ligustrazine groups were significantly lower than those in the model group, and the expressions of bcl-2 were significantly higher than those in the model and low dose group (P<0.05). Conclusion Ligustrazine can effectively promote the proliferation of cartilage cells, but also through upward-regulation of anti apoptotic factor bcl-2 expression, down-regulation the expressions of Pro apoptotic factor Bax and Caspase-3 to inhibit the apoptosis of chondrocytes.

Key words:ligustrazine;rabbits;osteoarthritis;chondrocytes;proliferation;apoptosis