石决明对氧化应激所致白内障的作用研究*

周　宇　金　鑫　祁　磊　王玉斌　徐清妍　李秀娟　郑玛丽　钟瑞生　林　媛



【实验研究】

石决明对氧化应激所致白内障的作用研究*

周宇1金鑫1祁磊2王玉斌2徐清妍2李秀娟2郑玛丽2钟瑞生2林媛2

1.厦门大学医学院基础医学部(厦门 361102) 2.福建省厦门市中医院眼科(厦门 361009)

摘要：目的研究石决明提取物对体外培养的晶状体氧化应激性白内障形成的作用及机制。方法离体培养小鼠晶状体，应用不同浓度的石决明提取物预孵育晶状体24h后，加入1mm 过氧化氢，继续培养3小时后恢复正常培养，72小时后观察小鼠晶状体混浊程度，测定晶状体组织培养液中的乳酸脱氢酶(LDH)含量，晶状体组织中还原型谷胱甘肽(GSH)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活力。结果石决明提取物在1～2 mg/ml浓度范围内减轻氧化应激造成的晶状体混浊，减少晶状体LDH的释放，提高组织内GSH含量和SOD活力。结论石决明提取物可减轻氧化应激白内障的形成，其作用主要与石决明提取物提高内源性抗氧化系统有关。

关键词：石决明；白内障； 晶状体；氧化应激；小鼠

晶状体是一个透明、富有弹性的无血管屈光组织，在视觉形成过程中发挥重要作用。白内障即晶状体混浊, 是我国乃至全世界致盲的最主要原因之一。尽管白内障手术已日臻完善，但仍然存在手术费用较高，术后眼睛正常调节功能丧失，以及后发性白内障高发等问题，给患者带来诸多不便。特别随着人口的老龄化, 这一难题更为突出, 因此寻找安全、有效、廉价的药物治疗白内障具有重要的现实意义[1]。石决明是我国传统动物类中药，具有清肝明目的药效，临床上常用于治疗目赤翳障、青盲雀目、视物昏花等眼科疾患[2]。研究报道大鼠灌胃给予含有石决明有效成分的复方制剂决明退障丸可延缓硒性白内障的发生[3]。另有研究报道应用石决明提取液滴眼可延缓半乳糖诱导的大鼠白内障的发生[4]。以上研究结果提示石决明系统或局部给药均可延缓白内障的发生，但其作用机制尚不明确。最近一项研究报道石决明水提液可提高晶状体上皮细胞的抗氧化酶活性，减轻脂质过氧化损伤程度，保护晶状体上皮细胞[5]，提示石决明提取液可能通过维持晶状体氧化还原平衡，发挥抗白内障形成作用。为进一步明确石决明提取物对晶状体氧化应激损伤的作用，我们拟采用晶状体离体培养技术，应用过氧化氢(H2O2)诱导晶状体氧化应激损伤建立白内障模型，观察不同浓度的石决明提取液对晶状体氧化应激损伤的作用，并测定晶状体酶性和非酶性抗氧化指标的变化，探讨石决明对晶状体氧化损伤的抑制作用及机制。

1　材料和方法

1.1试验药物石决明由国家海洋局第三海洋研究所(厦门)提供。取石决明150 g用粉碎机粉碎后，过200目筛，加入4500ml(料液比=1:30)蒸馏水，90℃水浴冷凝回流2 h，重复提取两次，合并提取液，经抽滤浓缩至一定体积后，应用冷冻干燥机进行冻干干燥，得粉末0.7 g，提取率为0.467%。临用前用M199培养基配成相应的浓度，经0.22μM 微膜过滤备用。

1.2试验动物昆明种小鼠60 只，雄性，体质量20～22 g，SPF级，购自厦门大学实验动物中心，许可证号 SYXK(闽)2008～0003。自然光照周期饲养，小鼠适应环境饲养 1 周后进行实验。

1.3试剂M199组织培养基，美国Gibco公司；胎牛血清，美国sigma 公司；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)检测试剂盒，碧云天生物技术研究所；谷胱甘肽(glutathione，GSH)检测试剂盒及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)检测试剂盒，南京建成生物工程研究所。其余均为国产市售分析纯产品。1.4仪器多功能酶标仪(Molecular Device, 美国)；组织匀浆机(IKA Labortechnik 公司，德国)；冷冻高速离心机(sigma 公司，美国)；小宝多功能粉碎机(永康市小宝电器有限公司)；旋转蒸发仪 (上海爱朗仪器有限公司)；低温冷却循环泵(郑州长城科工贸有限公司)；电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)；超净工作台(苏州安泰)；CO2培养箱( Thermo Forma公司，美国)；显微手术器械(上海医疗器械有限公司手术器械厂，中国)；ZSA0850体式显微镜(重庆光学，中国)。

1.5方法

1.5.1DPPH法测定石决明的抗氧化作用将石决明提取物用70%乙醇配成不同浓度的溶液备用，DPPH用70%乙醇配成0.04mg/ml的溶液，吸取提取物溶液75μl于孔板中，加入DPPH溶液225μl作为样品组；以70%乙醇代替DPPH溶液作为样品背景组，以70%乙醇代替提取物溶液作为阴性对照组，置于30度培养箱中反应30min,混匀后于室温避光静置30 min，在517nm处测定吸光度值，其中样品孔为B, 样品背景孔为C， 阴性对照孔为A。按以下公式计算提取物对DPPH自由基的清除率，平行测定3次。计算石决明不同提取物对DPPH自由基清除的IC50值。DPPH清除率(%)={1-(B-C)/A}*100%。

1.5.2晶状体体外培养及实验分组颈椎脱臼法处死小鼠，快速取出眼球，用75%乙醇冲洗1次，用生理盐水冲洗两次后，将眼球放入37℃ 预热的M199培养液中，在无菌室超净工作台上，从后路小心剖开眼球，除去球壁和玻璃体，剥离悬韧带，取出晶状体，后极朝下置入含4ml 10%胎牛血清的M199培养液的6孔培养板中，每孔1只晶状体。于37℃，5% CO2培养箱中孵育24 h后，弃除混浊的晶状体，选取透明晶状体用于实验。晶状体随机分为7组，每组8只，分别置入含有下列试剂的6孔培养板中。①空白对照组： M199 培养基;②石决明处理组：含 2mg/ml 石决明的M199 培养基；③维生素C处理组：含10mmol/ml维生素C的M199 培养基；④H2O2处理组：含 1 mmol/L H2O2的M199培养基；⑤石决明低剂量组：含 1 mmol/L H2O2和 0.1mg/ml 石决明的M199培养基；⑥石决明中剂量组：含 1 mmol/L H2O2和 1 mg/ml 石决明的M199培养基；⑦石决明高剂量组：含 1 mmol/L H2O2和 2 mg/ml 石决明的M199培养基。

各组晶状体药物预保护24 h，加入过氧化氢攻击3 h，换为正常培养液继续培养72 h。1.5.3晶状体透明度的观察及灰度值的测定将晶状体置于白色背景垂直交叉的黑色线条上或黑色背景下，用带拍照系统的体式显微镜拍照，前者用于晶状体透明度的观察，后者用ImageJ图像分析软件计算晶状体灰度值。

1.5.4晶状体培养上清液中LDH的测定取各组晶状体组织的培养液，按照试剂盒操作说明，测定各组培养液中LDH值，反映晶状体上皮细胞的损伤情况。

1.5.5晶状体组织内GSH含量和SOD活力的测定用圈匙从培养液中取出晶状体，用预冷的生理盐水漂洗，滤纸吸干称重。放入盛有冰生理盐水的玻璃匀浆器内，按重量体积1:9进行组织匀浆，低温 3000 r/min离心 15 min，取上清液，参照试剂盒说明测定晶状体内SOD活力值和GSH含量，反映晶状体酶系和非酶系的抗氧化能力。

2　结果

2.1石决明提取物对DPPH自由基清除活性的影响 应用DPPH法测定石决明提取物体外抗氧化能力，结果表明石决明提取物具有一定清除自由基的能力，在0.5～2mg/ml的浓度范围内剂量依赖性地清除DPPH自由基(图1)。

图1　石决明提取物对DPPH的清除率

2.2石决明提取物对晶状体形态学的影响体外培养的小鼠晶状体经1 mm H2O2攻击3 h，恢复正常培养72 h后，在体式显微镜下可见晶状体皮质和核均出现混浊，无法透过晶状体观察下面的网格线。0.1 mg/ml及2 mg/ml的石决明提取液剂量依赖性的改善晶状体的混浊程度。单用2 mg/ml的石决明提取物对晶状体的形态无明显影响，表明高浓度的石决明提取液对晶状体亦无明显毒性。作为阳性对照药维生素C(10 mM)也能明显改善H2O2造成的晶状体混浊(图 2)。

图2　石决明提取物对H2O2作用后体外培养晶状体形态学的影响

2.3石决明提取物对晶状体透明度的影响图3a所示，离体培养的小鼠晶状体经1 mm H2O2攻击3 h，恢复正常培养72 h后晶状体的透明度明显下降。应用ImageJ图像分析软件计算晶状体灰度值，结果表明模型组(单用H2O2组)晶状体的灰度值与正常组相比增加了1.2倍。石决明提取物剂量依赖性地降低晶状体的灰度值，提高晶状体的透明度。其中2 mg/ml石决明提取物效果最好，与模型组相比，晶状体的透明度显著性增加，灰度值减少了24%(图3 b)。作为阳性对照药，10 mm维生素C也明显减少晶状体的灰度值，提高晶状体的透明度，其作用与高浓度石决明提取物的作用接近。

2.4石决明提取物对晶状体培养液中的LDH的影响图4所示，离体培养的小鼠晶状体经1 mm H2O2攻击3 h，恢复正常培养72 h后，模型组培养液中的LDH渗漏量是正常组的2.8倍，提示H2O2造成晶状体上皮细胞损伤，细胞膜破裂，LDH渗漏增加。各浓度石决明提取物剂量依赖性地减少晶状体培养液中LDH的渗漏，其中2 mg/ml的石决明效果最好，与模型组相比，LDH渗漏量减少28%，说明石决明可保护晶状体上皮细胞，对抗氧化应激损伤。单用石决明提取物对晶状体上皮细胞无明显影响。作为阳性对照药，10mm维生素C也可减少LDH的渗漏。

2.5石决明提取物对晶状体组织中GSH含量的影响离体培养的小鼠晶状体经1 mm H2O2攻击3 h，恢复正常培养72 h后，晶状体中GSH含量较正常对照组下降了60%， 提示氧化应激造成晶状体中内源性抗氧化剂明显减少。各浓度石决明提取物剂量依赖性地升高晶状体中GSH含量，其中2 mg/ml石决明组GSH含量较模型组升高了41%。其升高GSH的幅度与阳性对照药维生素C接近，后者升高GSH的含量与模型组相比为52%(图5)。

2.6石决明提取物对晶状体SOD活力的影响离体培养的小鼠晶状体经1 mm H2O2攻击3 h，恢复正常培养72 h后，晶状体中SOD活力与正常对照组相比下降了38%(图6,P<0.01)，提示H2O2破坏了晶状体中内源性抗氧化物酶的活力。各浓度石决明提取物剂量依赖性地升高晶状体中SOD活力，其中2 mg/ml的石决明与模型组相比，晶状体中SOD的活力升高了35%，接近阳性对照药维生素C(图6)。

3　讨论

本研究首次利用晶状体离体培养技术，观察不同浓度的石决明提取物对H2O2诱导的小鼠晶状体氧化应激损伤的保护作用并分析其作用机制。晶状体的氧化应激损伤是诱发白内障特别是老年性白内障的重要因素。晶状体组织结构中没有血管，其能量主要由葡萄糖的无氧酵解供给，因此晶状体在代谢过程中不可避免的产生大量的氧自由基如超氧阴离子，羟自由基和H2O2，对晶状体中的膜与蛋白造成氧化应激反应，从而不同程度地影响晶状体透明度。但同时晶状体本身亦存在完善的抗氧化体系，可以清除不断产生的过氧化物和自由基，保持透明度。但在某些情况下, 如体内氧化物质产生过多或晶状体清除氧自由基的能力下降, 晶状体则发生氧化应激损伤，形成白内障。临床研究亦发现在正常及白内障眼的晶状体及房水中均存在一定量的H2O2，且白内障患者眼内H2O2的含量较正常人明显增高[6]。因此具有氧自由基清除能力或提高晶状体内源性抗氧化能力的物质将有助于维持晶状体的透明性，延缓白内障的发生。我们的研究结果表明离体培养的小鼠晶状体经1 mm H2O2攻击3 h，恢复正常培养72 h后，模型组晶状体全部混浊即形成了白内障，而石决明提取物组晶状体仅部分出现雾样混浊,，无1例发生白内障。石决明提取物剂量依赖性地降低晶状体的浑浊度，其中2 mg/ml浓度的石决明提取物抑制氧化应激性白内障的作用甚至与阳性对照药维生素C相当。以上研究结果进一步明确了石决明提取物抗氧化应激性白内障形成的作用。

图3　石决明提取物对H2O2作用后体外培养晶状体透明度的影响

图4　石决明提取物对H2O2作用后体外培养晶状体培养液中LDH渗漏的影响

图5　石决明提取物对H2O2作用后体外培养晶状体GSH含量的影响

图6　石决明提取物对H2O2作用后体外培养晶状体SOD活力的影响

晶状体上皮细胞是晶状体代谢最活跃的部位, 是整个晶状体代谢的关键, 其形态与功能的正常与否直接影响晶状体的透明度。氧化应激首先损害晶状体上皮细胞，白内障的形成也和晶状体上皮细胞的损害密切相关。LDH是细胞内的标志酶，正常状态下细胞内漏出量很少。但细胞受损后，由于细胞膜通透性增加，LDH由细胞渗漏至培养液中的量明显增多，因此通过测定细胞培养液LDH 渗漏量可客观的衡量细胞受损的程度。我们的研究结果表明1 mm的H2O2可造成晶状体培养液中LDH渗漏明显升高，说明H2O2可损伤晶状体上皮细胞，而石决明提取液浓度依赖性地减少LDH的渗透，提示石决明提取液可能有助于对抗晶状体上皮细胞的氧化应激损伤。这一研究结果与研究报道石决明提取液可对抗H2O2造成的体外培养晶状体上皮细胞氧化应激损伤[5]是一致的。

正常人晶状体中同时存在非酶性和酶性内源性抗氧化系统[7]。非酶性抗氧化系统主要指一些低分子量抗氧化剂如GSH。GSH是晶状体中含量较多的内源性抗氧化活性物质，可以清除超氧阴离子、H2O2等氧自由基, 并维持晶状体蛋白的巯基呈还原状态, 防止蛋白变性, 对维持晶状体的透明度起重要作用。几乎在所有类型白内障晶状体内，GSH含量均下降，且随晶状体混浊加重而剧减，因此认为GSH缺乏是白内障的成因之一。抗氧化酶系统如SOD，是晶状体维持氧化还原平衡的另一重要系统。SOD有助于清除超氧阴离子自由基(O2-.)，保护细胞免受氧化应激损伤，在维持晶状体的氧化还原平衡中起重要作用。本研究结果也证明H2O2可损害晶状体的抗氧化体系，减少GSH含量和降低SOD活力，从而促进白内障的发生。石决明提取物在升高晶状体内GSH含量和SOD活力的同时，也改善晶状体的透明度，从而延缓白内障的进展。

石决明来源于软体动物门鲍科动物的贝壳，可分为角质层、棱柱层和珍珠层。石决明主要化学成分90%以上为碳酸钙，有机组分仅占3.67%，且主要位于珍珠层，但这少量的的珍珠层可能是石决明发挥抗白内障作用的重要成分。研究报道珍珠层中含有镁、铁、锌、锶、硒、铜、碘等无机微量元素，均为人体中缺乏而又很难补充的微量元素，其中锌是维持晶状体内糖无氧酵解酶系中不可缺少的微量元素；石决明的珍珠层经盐水解可得到16种氨基酸，能增强透明质酸、硫酸软骨索等的合成，从而保护眼睛晶状体[8]。此外，石决明中的抗氧化成分亦是其发挥抗氧化应激性白内障形成的重要因素。研究报道石决明珍珠层与珍珠的成分非常相似，而后者水提液具有很高的活性氧自由基清除活性，并能延缓白内障的发生[9]。本研究应用DPPH法测定石决明提取物的体外抗氧化能力，结果表明石决明提取物在体外具有一定的直接清除氧自由基的能力，但明显弱于维生素C。但在离体培养的晶状体氧化应激性白内障模型上，本研究发现2 mg/ml的石决明提取液增加晶状体GSH含量和提高SOD活力的作用与10mm的维生素C相当，并且其减轻氧化应激性白内障形成的作用也与维生素C相当。因此本研究结果提示石决明提取物提高晶状体抗氧化能力可能是其对抗氧化应激性白内障形成的主要机制。

总之，本研究结果表明石决明提取液可明显减少H2O2诱导的白内障形成，其作用机制与其保护晶状体SOD活性，维持GSH含量，减少晶状体上皮细胞的损伤有关。石决明作为一种天然药物, 来源广泛，且无明显不良反应，因此石决明对晶状体的保护作用意义重大，若将其开发为系统性或局部性预防及治疗白内障的天然药物，将具有广阔的应用前景。

参考文献

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*基金项目：2012年福建省卫生厅中医药科研专项课题(No.WST201210)；2013年福建省卫生厅中医药科研专项课题(No.wzhw201302)；2014年厦门市科技局科技惠民项目课题(No.3502Z20144030)

doi:10.3969/j.issn.1003-8914.2016.05.021

文章编号：1003-8914(2016)-05-0650-06

收稿日期：(本文校对：林媛2015-06-23)

Experimental Study of the Abalone Shell on Cataract induced by Oxidative Stress

ZHOU Yu1JIN Xin1QI Lei2WANG Yubin2XU Qingyan2ZHENG Mali2ZHONG Ruisheng2LIN Yuan2

(1. Department of Pharmacology, Medical School, Xiamen University, Fujian, Xiamen 361102, China;2. Department of Ophthalmology, Xiamen Hospital of TCM, Fujian, Xiamen 361009, China)

Abstract：ObjectiveTo study the effect of the abalone shell extract on oxidative stress induced cataract formation and its mechanism in cultured mouse lens in vitro. MethodsThe cultured mouse lens were pretreated with the abalone shell extract in different concentrations for 24 hours, and then 1mm hydrogen peroxide was added and continued incubating for 3 hours, and they were changed to normal culture media. After 72 hours, the opacity of each lens was observed under an anatomical microscope, the content of lactate dehydrogenase (LDH) leakages, the content of the reduced glutathione (GSH) and activity of superoxide dismutase (SOD) in lens tissue were assayed. ResultsAbalone shell extract in the concentration range of 1～2 mg / ml reduced the lens opacity caused by oxidative stress, alleviated the release of LDH, and increased GSH content and SOD activity in cultured lens. ConclusionAbalone shell extract can alleviate the oxidative stress induced cataract formation, and this effect is mainly related to its improvement of the endogenous antioxidant system in lens.

Key words：Abalone shell; Cataract; Lens; Organ culture, Oxidative stress; Mouse