一种天然五环三萜化合物的合成及抑制活性研究*

王友德，张丽颖

(河北省中药研究与开发重点实验室，承德医学院中药研究所，河北　承德　067000)



一种天然五环三萜化合物的合成及抑制活性研究*

王友德，张丽颖

(河北省中药研究与开发重点实验室，承德医学院中药研究所，河北承德067000)

以积雪草酸为原料首次利用化学方法对2α,23-二乙酰氧基积雪草酸进行了化学合成研究，所有化合物均经IR、1H-NMR、13C-NMR和MS测试确认结构。对所有化合物的糖原磷酸化酶抑制活性的研究结果表明，所合成的衍生物显示出了一定的糖原磷酸化酶抑制活性,其中积雪草酸苄酯5(IC50=3.81μM)的糖原磷酸化酶抑制活性优于其先导化合物积雪草酸(IC50=17μM)。

五环三萜；2α,23-二乙酰氧基积雪草酸；糖原磷酸化酶

乙酰五环三萜是天然五环三萜化合物中的一类重要化合物，存在于多种植物中。大量研究表明，该类化合物具有广泛的生物活性，如降血糖、降血脂、抗肿瘤、抗炎以及机体免疫调节等[1-4]。如3-O-乙酰基齐墩果酸 (1)是刺枝豆属植物Eysenhardtia platycarpa树干的主要活性成分，可以显著降低链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠的血糖[5]。3-O-乙酰基-16-羟基白桦酸(2)是古夷苏木(Fagara tessmannii)中的重要成分，具有显著的α-糖苷酶的抑制活性[6]。α-乙酰乳香酸(3)是中药乳香的有效成分，对拓朴异构酶I和II有较强的抑制活性[7]。

1971年，Gupta A S等从龙脑香科植物树干分泌的树脂中分离得到的一个天然五环三萜化合物，2α,23-二乙酰氧基积雪草酸(4)，该化合物也是一个天然乙酰五环三萜化合物，其化学结构中具有两个乙酰氧基的结构单元[8]。但是，由于该化合物在自然界中含量很少，只靠提取对其进行制备很难得到足够的量对其进行相应的药学研究。因此需要一种有效的合成方法对这类化合物的深入药学研究提供原料保证。因此，我们以积雪草酸为原料，巧妙的利用转酯化反应，对2α,23-二乙酰氧基积雪草酸进行了首次化学合成研究，具体合成路线见图2，并对合成中所涉及到的所有化合物进行了初步的糖原磷酸化酶抑制活性研究。

图1　天然乙酰五环三萜的化学结构

图2　2α,23-二乙酰氧基积雪草酸的合成路线

1　仪器与材料

AVANCE-300MHz型核磁共振仪,德国Bruker；SHIMADZU FTIR-8400S傅里叶变换红外光谱仪,德国Bruker；HP1100LC/MSD,美国PE；maXis impact-HRMS,德国Bruker；RY-1熔点仪,天津市分析仪器厂；酶标仪,美国BIO-RAD公司。试剂均为化学纯或分析纯试剂。

2　方法与结果

2.1化合物的合成与表征

2.1.12α,3β-二羟基-23-叔丁基二甲基硅氧基熊果烷-12-烯-28-羧酸苄酯(6)

将3β-羟基齐墩果烷-12-烯-28-羧酸-6-[4-(4-氨基苯甲酰基)苯甲酰氧基]己基酯(0.49 g,0.85 mmol)溶于DMF(5mL)中，缓慢加入咪唑(0.13 g,1.91 mmol)，叔丁基二甲基氯硅烷(0.13 g,0.85 mmol)，室温搅拌过夜，反应液倾入冰水(20mL)中、乙酸乙酯(30mL×3)萃取。然后依次以水和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后蒸去溶剂。快速柱层析(石油醚/乙酸乙酯=8/1,V/V)，得淡黄色固体(0.13 g,22%)。IR (KBr,cm-1):3409,2924,1724,1454。1H-NMR (300 MHz):0.06 (6H,s),0.63 (3H,s),0.84 (6H,s),0.86 (3H,s),0.90 (6H,s),0.91,0.94,0.99,1.06 (each 3H,s),2.26(1H,d,J=11.3 Hz),3.31-3.40 (2H,m),3.59 (1H,d,J=9.4 Hz),3.70～3.78 (1H,m),4.97 (1H,dd,J=12.5,34.7 Hz),5.09 (1H,dd,J=12.5,34.7 Hz),5.24 (1H,t),7.29～7.37 (5H,m)。13C-NMR (75 MHz):177.2; 138.1; 136.4; 128.4; 128.1; 127.9; 125.6; 80.5; 71.3; 68.6; 66.0; 52.9; 49.1; 48.1; 47.5; 45.9; 42.2; 42.1; 39.5; 39.1; 38.8; 37.9; 36.6; 32.6; 30.7; 27.9; 25.8; 24.2; 23.4; 23.3; 21.1; 18.4; 17.1; 17.0; 12.9; -5.6; -5.7。ESI-MS:691.5[M-H]-。

2.1.22α,3β-二乙酰氧基-23-叔丁基二甲基硅氧基熊果烷-12-烯-28-羧酸苄酯(7)

将科罗索酸(0.10 g,0.14 mmol)溶于吡啶(5mL)，缓慢加入乙酸酐(0.03mL,0.31 mmol)，室温搅拌过夜。减压蒸去吡啶，残留物以乙酸乙酯溶解后依次以1 N盐酸、饱和碳酸氢钠溶液和水洗涤，无水硫酸钠干燥。除去干燥剂，母液蒸去溶剂后快速柱层析(石油醚/乙酸乙酯=8/1，V/V)得白色固体(0.08 g,74%)。m.p.159～161℃。IR (KBr,cm-1):2927,2857,1743,1250。1H-NMR (300 MHz):0.05 (6H,s),0.63,0.74 (each 3H,s),0.91 (15H,s),1.05 (9H,s),1.99,19.6 (each 3H,s),2.26(1H,d,J=11.5 Hz),2.98 (1H,dd,J=10.1 Hz),3.20 (1H,dd,J=10.2 Hz),4.97 (1H,dd,J=12.4,37.1 Hz),5.10 (1H,dd,J=12.4,37.1 Hz),5.13～5.15 (2H,m),5.22 (1H,t),7.29～7.35 (5H,m).13C-NMR (75 MHz):177.2; 171.0; 170.7; 170.1; 169.8; 138.4; 138.2; 136.4; 128.4; 128.4; 128.2; 128.1; 128.0; 125.4; 125.2; 77.7; 74.8; 70.6; 67.4; 66.0; 65.6; 64.2; 53.0; 52.9; 48.2; 48.1; 48.0; 47.5; 46.1; 43.9; 43.2; 42.2; 42.1; 41.8; 39.6; 39.4; 39.1; 38.8; 37.7; 37.6; 36.6; 32.6; 32.3; 30.7; 29.7; 27.9; 25.8; 25.7; 24.2; 23.4; 23.3; 22.7; 22.6; 21.2; 21.1; 20.9; 20.7; 18.0; 17.7; 17.2; 17.1; 17.0; 17.0; 16.9; 16.9; 14.1; 14.0; 14.0; -4.3; -4.8; -5.8; -5.9。ESI-MS:777.5[M+H]+。

2.1.32α,23-二乙酰氧基-3β-羟基熊果烷-12-烯-28-羧酸苄酯(8)

将2α,3β-二乙酰氧基-23-叔丁基二甲基硅氧基熊果烷-12-烯-28-羧酸苄酯(0.1 g,0.13 mmol)溶于四氢呋喃(2mL)中，冰浴下加入四丁基氟化胺(40 mg,0.15 mmol)，室温搅拌反应过夜。反应液以乙酸乙酯稀释后，饱和食盐水洗涤，无水Na2SO4干燥。过滤，浓缩，快速柱层析 (石油醚/乙酸乙酯=1/1,V/V)，得白色固体(48 mg,56%)。m.p.198～200℃。IR(KBr,cm-1):2923,2870,1727,1240。1H-NMR(300 MHz):0.62 (3H,s),0.83 (3H,d,J=5.5 Hz),0.96,1.05,1.06 (each 3H,s),2.06,2.07 (each 3H,s),2.26(1H,d,J=11.4 Hz),3.49 (1H,d,J=10.0 Hz),3.92 (1H,dd,J=11.3,43.3 Hz),4.07 (1H,dd,J=11.3,43.3 Hz),4.92～5.06 (2H,m),5.10 (1H,d,J=12.5 Hz),5.22 (1H,t),7.28～7.37 (5H,m)。13C-NMR (75 MHz):177.2; 171.4; 170.9; 138.3; 128.4; 128.3; 128.0; 125.3; 74.7; 72.8; 66.1; 66.0; 53.0; 48.2; 47.8; 47.6; 43.7; 42.8; 42.1; 39.6; 39.1; 38.9; 38.0; 36.6; 32.6; 30.7; 27.9; 24.2; 23.5; 23.4; 21.3; 21.2; 20.9; 18.1; 17.0; 17.0; 13.1.ESI-MS:685.4[M+Na]+。

2.1.42α,23-二乙酰氧基-3β-羟基熊果烷-12-烯-28-羧酸 (2α,23-二乙酰氧基积雪草酸)(4)

将3β-棕榈酰基齐墩果烷-12-烯-28-羧酸苄酯(0.30 g,0.45 mmol)溶于四氢呋喃(10mL)中，加入催化量的10%Pd/C，室温常压氢化24 h。常压过滤除去Pd/C，滤液蒸干得到粘稠状液体。柱层析(石油醚/乙酸乙酯=20:1,V/V)分离，得到白色固体(0.21 g,82%)。m.p.160～162℃。IR (KBr,cm-1):2924,2870,1729,1240。1H-NMR (300 MHz):0.77 (3H,s),0.83 (3H,d,J=4.9 Hz),0.95 (3H,s),1.08 (9H,s),2.07,2.08 (each 3H,s),2.19 (1H,d,J=11.2 Hz),3.49 (1H,d,J=10.1 Hz),3.93 (1H,d,J=11.4 Hz),4.09 (1H,d,J=11.4 Hz),5.00～5.06 (1H，m),5.24 (1H,t)。13C-NMR (75 MHz):182.9; 171.4; 170.9; 138.1; 125.4; 76.6; 72.7; 66.1; 52.6; 48.0; 47.7; 47.6; 43.7; 42.8; 42.0; 39.6; 39.1; 38.8; 38.0; 36.7; 32.6; 30.6; 29.7; 28.0; 24.1; 23.5; 23.4; 21.3; 21.2; 20.9; 18.1; 17.1; 16.9; 13.1。ESI-MS:595.5[M+Na]+。

2.2化合物对糖原磷酸化酶的抑制活性测试

参照文献[9]方法，对本文合成的4个化合物，以咖啡因为阳性对照，进行了抑制兔肌肉糖原磷酸化酶(RMGPa)活性测试。操作流程如下：在微孔板中加入反应缓冲液，加入待测化合物及RMGPa，室温温孵20 min，加入显色液(钼酸铵和孔雀绿)，用BIORAD多功能酶标仪测定(检测波长：655 nm)。

2.3糖原磷酸化酶抑制活性结果与讨论

表1　4个新化合物对RMGPa的抑制活性

a每个结果都是三组实验的平均值;bNI 为无抑制活性;c以咖啡因为阳性对照。

本文测定了4个新化合物对RMGPa的抑制活性，结果见表1。结果显示：所合成的衍生物显示出了一定的糖原磷酸化酶抑制活性，其中积雪草酸苄酯(5)(IC50=3.81μM)的抑制活性优于其先导化合物积雪草酸(IC50=17μM)。遗憾的是，所合成的天然产物2α,23-二乙酰氧基积雪草酸(4)并未显示出GP抑制活性，这点之前文献报道的三乙酰氧基积雪草酸活性类似，提示3位羟基应为GP抑制活性必须基团。关于该天然产物的其他药理活性正在进一步研究中。

3　结　论

以积雪草酸为母核，共合成3个新的未见文献报道的积雪草酸衍生物，对实验中涉及到的米而文芳基化反应条件进行了摸索及讨论，使得反应副产物相对减少，提高了产率。对所合成的3个衍生物进行了糖原磷酸化酶抑制活性测试。活性测试结果显示3个化合物均显示出一定的糖原磷酸化酶抑制活性。后续工作中，我们将继续系统的开展不同取代基类别对酶抑制活性的构效关系研究。

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Synthesis and Evaluation of Natural Compounds of Pentacyclic Triterterpenes as Inhibitors of Glycogen Phosphorylase*

WANG You-de,ZHANG Li-ying

(Key Laboratory of Research and Exploiture for New Drugs of Chinese Materia Medicine,Institute of Chinese Materia Medica,Chengde Medical College,Hebei Chengde 067000,China)

For the first time,we did research into 2α,23-diacetoxy asiatic acid by chemical process from asiatic acid and all compounds were confirmed by IR,1H-NMR,13C-NMR and MS.They also have been tested biological inhibitory activity of all compounds by using glycogen phosphorylase.The research results indicated that asiatic acid benzyl ester 7 showed optimal inhibition with the IC50of 3.81μM.

Pentacyclic Triterterpenes; 2α,23-diacetoxy asiatic acid; Glycogen Phosphorylase

河北省教育厅资助项目(No.Y2012026)。

张丽颖(1981-)，女，副教授，主要从事药物设计与合成研究。

R914.5

A

1001-9677(2016)011-0059-03