一种用于桑RAD-Seq高通量测序的基因组DNA提取方法

刘 玲, 柯皓天, 吕 银, 陈仁芳

(1.四川省丝绸科学研究院，四川成都 610031；2.四川省丝绸工程技术研究中心，四川成都 610031；3.西南大学生物技术学院，重庆 400716)



一种用于桑RAD-Seq高通量测序的基因组DNA提取方法

刘 玲1, 柯皓天1, 吕 银2, 陈仁芳3*

(1.四川省丝绸科学研究院，四川成都 610031；2.四川省丝绸工程技术研究中心，四川成都 610031；3.西南大学生物技术学院，重庆 400716)

[目的]筛选一种能够得到高质量桑树基因组DNA的方法。[方法]采用天根试剂盒法(Plant Genomic DNA Kit 离心柱型)，并稍加改进，从11个桑种的新鲜嫩叶中提取DNA。[结果]该方法简单快速，不需要复杂仪器，且能有效地除去桑叶中的多糖、多酚、蛋白质等杂质，得到的DNA能够满足RAD-Seq高通量的测序要求。[结论]建立了一种用于桑RAD-Seq高通量测序的基因组DNA提取方法。关键词桑树；RAD-Seq；基因组DNA提取

高质量基因组DNA通常用于构建基因组文库、Southern杂交及PCR分离基因等。因此，选用合适的提取方法获取高质高量DNA非常重要[1]。RAD-Seq，即限制性酶切位点相关DNA的测序技术，是利用限制性内切酶对基因组进行酶切，产生一定大小的片段，构建测序文库，对酶切后产生的RAD片段进行高通量测序[2]。常用的植物基因组DNA提取方法有CTAB法[3]和SDS法[4]，但利用这2种方法得到的桑DNA很难满足RAD-Seq测序的要求。桑RAD-Seq高通量测序对总DNA浓度的要求较高。桑树组织中含有较多的蛋白质、糖类、酚类等杂质，利用常用的提取方法很难得到高质量的DNA。笔者利用该方法能够得到较纯的桑树基因组DNA，满足RAD-Seq测序要求。

1　材料与方法

1.1试验材料供试材料为中国桑属11个种及变种，分别为白桑Morusalba，蒙桑M.mongolica，长穗桑M.wittiorum，鸡桑M.australis，奶桑M.macroura，细齿桑M.serrata，鬼桑M.mongolicavar.diabolica，川桑M.notabilis，黑桑M.nigra，华桑M.cathayana，滇桑M.yunnanensis。材料采自各原产地，采集时用带冰块的泡沫塑料盒盛装，尽快采回于-80 ℃冰箱保存备用。

1.3DNA质量检测

1.3.1琼脂糖凝胶电泳检测。取3 μL DNA溶液，加入2 μL 6×Loading buffer，用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，用DL 2 000 Maker做参照。150 V电泳20 min后，用EB染色，然后在紫外凝胶成像系统下观察并拍照。

1.3.2紫外分光光度计检测。取1 μL DNA样品，用Nanodrop分光光度计(ND-1000，Thermo Fisher Scientific，USA)检测DNA浓度和纯度(A260/A280)。

2　结果与分析

2.1DNA电泳检测结果琼脂糖凝胶电泳检测结果见图1。从图1可以看出，电泳条带明亮、清晰，无拖尾、弥散现象，说明该方法提取的桑树DNA无降解现象,基因组完整性好，浓度较高。

注：M.maker，1.白桑，2.蒙桑，3.长穗桑，4.鸡桑，5.奶桑，6.细齿桑，7.鬼桑，8.川桑，9.黑桑，10.华桑，11.滇桑。Note：M.maker, 1.M.alba, 2.M.mongolica, 3.M.wittiorum, 4.M.australis, 5.M.macroura, 6.M.serrata, 7.M.mongolica var.diabolica, 8.M.notabilis, 9.M.nigra, 10.M.cathayana, 11.M.yunnanensis.图1　DNA提取琼脂糖电泳图谱Fig.1　Genomic DNA detected by agarose gel electrophoresis

2.2DNA浓度和纯度A260/A280是检测DNA纯度的指标，A260/A280在1.8～2.0，说明DNA纯度较高；A260/A280大于2.0时，说明DNA样品中含有RNA；A260/A280小于1.8时，说明DNA样品中可能存在蛋白质污染。用Nanodrop分光光度计(ND-1000，Thermo Fisher Scientific，USA)检测提取的DNA浓度和纯度，结果见表1。由表1可知，A260/A280在1.80～1.90，浓度在92.5 ng/μL以上。说明所提取的DNA较纯，符合进一步分析要求。

表1　桑种A260/A280

3　结论

该方法简单快速，不需要复杂仪器，且能有效地除去桑叶中的多糖、多酚、蛋白质等杂质，得到的DNA经华大基因检测能够满足RAD-Seq高通量测序要求。

[1] 吴艳艳, 代德艳, 蔡春梅.一种改良的大豆DNA提取方法[J].大豆科学, 2015, 34(1)：112-115.

[2] 王洋坤, 胡艳, 张天真.RAD-seq技术在基因组研究中的现状及展望[J].遗传, 2014, 36(1):41-49.

[3] 蔡朝晖, 李萍, 董婷霞, 等.贝母的分子生物学鉴定方法的研究[J].药学学报,2000, 35(4):309-312.

[4] DOYLE J J, DOYLE J L． A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue[J].Phytochemical bulletin, 1987, 19:11-15.

[5] 天根生长科技(北京)有限公司.天根试剂盒Plant Genomic DNA Kit植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)使用说明书[Z].2016.

A High Throughput Sequencing DNA Extraction Method forMorusRAD-Seq

LIU Ling1, KE Hao-tian1, LU Yin2, CHEN Ren-fang3*

(1.Silk Research Institute of Sichuan Province, Chengdu, Sichuan 610031; 2.Sichuan Silk Engineering Research Center, Chengdu, Sichuan 610031; 3.Biotechnology School of Southwest University, Chongqing 400716)

[Objective] The aim was to screen out a method to obtain high quality DNA from mulberry genome.[Method] By using improved Plant Genomic DNA Kit centrifugal column method, DNA was extracted from 11 species of fresh mulberry leaves.[Result] The method is simple, rapid, and can effectively remove polysaccharides, polyphenols, protein and other impurities in the mulberry leaves, the DNA is able to meet the RAD-Seq high-throughput sequencing requirements.[Conclusion] A DNA extraction method for Morus RAD-Seq sequencing was established.

Mulberry; RAD-Seq; Genomic DNA extraction

刘玲(1989- )，女，山西大同人，硕士，从事桑树分子标记研究。*通讯作者，副研究员，博士，从事桑资源及分类研究。

2016-06-12

S 188

A

0517-6611(2016)21-136-02